基于“off‑on‑off ”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片技术

本发明专利技术公开了基于“off‑on‑off”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片。该方法中，随着待测样品中的Hg2+的浓度逐渐增加，Hg2+首先与杂交液中的TQ形成T–Hg2+–T结构，与TQ配对的带荧光标记的AC以游离状态存在，随后AC与芯片表面固定的探针TP发生杂交反应而被捕获，表现为荧光逐渐增强，即“off–on”模式”；然后，随着Hg2+的浓度继续增加，剩余Hg2+与芯片上的探针TP形成T–Hg2+–T结构，而原在芯片上捕获的AC被取代，从荧光探针表面离开，表现为荧光逐渐衰减，即“on–off”模式”；根据荧光探针芯片所检测得到的荧光强度确定待测溶液中Hg2+的浓度。本发明专利技术基于T‑T错配原理，借助于两次目标诱导的构象变化，结合光纤的倏逝波荧光检测平台，可实时检测Hg2+。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基于“off-on-off”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片。
技术介绍
近年来我国已发生了多起重金属汞的污染事件，严重威胁着广大人民群众的身体健康和生态安全。为控制汞离子(Hg2+)经摄入进入人体内，《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)严格限定饮用水中汞离子(Hg2+)的浓度不能高于0.001mg/L，并基于原子荧光光谱(ACS)、电感耦合等离子体质谱(ICP/MS)等仪器开发了检测痕量Hg2+的标准方法(GB/T4470-1998、GB/T23362.4-2009等)。尽管标准的仪器方法检测饮用水中Hg2+具有灵敏、准确等优点，但也存在着样品前处理复杂，仪器设备昂贵，检测时间长等问题，难以实现快速现场检测或对突发水污染事件做出快速响应。近年来研究发现汞离子(Hg2+)能够与胸腺嘧啶(T)特异结合，形成T-Hg2+-T错配结构，这就为汞离子(Hg2+)的快速、特异识别提供一条便捷的途径。目前基于错配原理的生物传感器得到快速发展并已应用于Hg2+离子的现场和在线检测之中。在这些方法中，由于具有高灵敏度，选择性强，检测速度快等特点，使基于目标诱导构象转变(Target-inducedconformationalswitching)检测策略的生物传感器受到更多的关注。Long等人利用目标诱导靶诱导结构转换开发了一种“Turnoff”模式的光纤生物传感器。该生物传感器可以高灵敏度检测Hg2+，检出限低至1.2nm，在数分钟内可以检测浓度在1.2nm到10μM范围的Hg2+。Du等人设计了一种荧光双探针的芯片基生物传感器，该传感器使用“Turnon”检测模式对Hg2+的检测限可达8.6nM，但检测需要两个费时的DNA杂交过程。可见上述研究还存着易产生假信号或者检测时间长的问题，并不能满足实际检测的需要。因此，研制适合汞离子(Hg2+)检测的快速、灵敏和宽范围的检测方法已成为防治汞离子(Hg2+)污染的迫切需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于“off-on-off”模式的汞离子的荧光检测方法及荧光探针芯片，该方法的检测限为0.4nM，检测范围为0.4nM-50μM，检测时间在15min以内。本专利技术提供的一种用于检测汞离子的荧光探针芯片的制备方法，它包括如下步骤：a)将基片表面的羟基进行活化；b)将经步骤a)处理的基片表面进行硅烷化；c)将经步骤b)处理的基片表面进行偶联化；d)将名称为TP的单链DNA探针固定在经步骤c)处理的基片表面，所述固定的步骤如下：将经步骤c)处理的基片在名称为TP的单链DNA探针溶液中浸泡16～20小时，取出基片，依次进行清洗和干燥；所述TP为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA，所述单链DNA的端部修饰有氨基。上述的制备方法，步骤a)中，所述基片可表面具有二氧化硅膜的基片，如为硅片、石英片、玻璃片或光纤基片。所述活化的步骤可如下：将所述基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，在70～110℃(如80℃)下静置45～90分钟(如60分钟)，取出基片进行洗涤和干燥，然后100～120℃(如120℃)静置3～12h(如3小时)。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法可如下：将3体积份浓硫酸和1体积份30％过氧化氢混合。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法具体如下：将3体积份浓硫酸(即质量分数为98.3％的硫酸溶液)和1体积份30％过氧化氢(即质量分数为30％的过氧化氢溶液)混合。步骤b)中，所述硅烷化的步骤可如下：将经步骤a)处理的基片浸泡于硅烷化剂溶液中，室温静置10～60min(如10min)，取出基片进行洗涤和干燥，在130℃～200℃(如180℃)下烘烤1～12h(如1h)，得到表面硅烷化的基片。所述硅烷化溶液的溶质可为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，溶剂可为无水乙醇或丙酮，APTES体积百分含量可为2％～10％(如6％)。步骤c)中，所述偶联化的步骤如下：将经步骤b)处理的基片浸泡于戊二醛偶联剂溶液中，室温静置30～120min(如60min)，取出基片进行洗涤和干燥，得到表面偶联化的基片。所述戊二醛偶联剂溶液的溶剂可为Tris-HCl缓冲液，体积百分含量为0.4％～5％(如2％)。步骤d)中，所述名称为TP的单链DNA探针溶液由名称为TP的单链DNA、NaCl和Tris-HCl缓冲液组成，其中，所述名称为TP的单链DNA探针的浓度为200～400nM(如300nM)，所述NaCl的浓度为50～200mM(如200mM)，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～50mM(如50mM)。所述浸泡的时间具体可为16小时；所述浸泡在室温条件下，湿度为55～75％的密闭环境中进行。所述干燥具体可为在室温条件用氮气吹干。所述氨基通常可修饰在所述名称为TP的单链DNA的任意一端，如5’端。所述方法在所述固定之后还包括将所述基片表面上的DNA进行封闭的步骤。所述封闭可采用浓度为10～50μM(如20μM)的甘氨酸水溶液，封闭时间可为1～5h(如1h)。上述的制备方法中，所述聚脱氧胸苷酸中脱氧胸苷酸的个数可为14～18，优选为16。所述氨基具体可来自NH2-(CH2)6。由上述任一项所述的制备方法制备得到的荧光探针芯片，也在本专利技术的保护范围内，该荧光探针芯片可实现基于“off-on-off”模式的汞离子的检测。包括上述的荧光探针芯片在内的用于检测汞离子的生物传感器，也在本专利技术的保护范围内。所述生物传感器可为全光纤倏逝波生物传感器。本专利技术进一步提供了一种基于“off-on-off”模式的汞离子的荧光检测方法，该检测方法中，随着待测样品中的Hg2+的浓度逐渐增加，Hg2+首先与名称为TQ的标记了荧光淬灭基团的单链DNA形成T–Hg2+–T结构，与TQ配对的名称为AC的标记了荧光基团的单链DNA以游离状态存在，随后所述AC(称之为靶标)与芯片表面固定的名称为TP的单链DNA探针发生杂交反应而被捕获，表现为芯片表面荧光逐渐增强，即“off–on”模式”；然后，随着Hg2+的浓度继续增加，剩余Hg2+与所述芯片上的探针TP形成T–Hg2+–T结构，而原在所述芯片上捕获的所述AC被取代，并从所述芯片表面离开，表现为荧光逐渐衰减，即“on–off”模式”；根据所述芯片所检测得到的荧光强度确定所述待测溶液中Hg2+的浓度。上述的检测方法中，所述方法可包括如下步骤：1)制备含有AC-TQ的杂交液；所述AC-TQ是由名称为AC的标记了荧光基团的单链DNA和名称为TQ的标记了荧光淬灭基团的单链DNA杂交而成的双链DNA，所述杂交液中不含游离状态AC；所述AC为含有聚脱氧腺苷酸的单链DNA，所述TQ为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA；2)将待测样品与所述含有AC-TQ的杂交液进行Hg2+诱导形成T–Hg2+–T结构反应，得到反应液，将所述反应液与所述的固定了DNA探针的荧光芯片进行杂交反应或者进行Hg2+诱导表面探针形成T–Hg2+–T的结构变化，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中汞离子的浓度。上述的检测方法中，步骤1)中，所述含有AC-TQ的杂交液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH7.2～7.4，浓度为10～50mM的Tris-HAc缓冲液；所述溶质为所述AC-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测汞离子的荧光探针芯片的制备方法，包括如下步骤：a)将基片表面的羟基进行活化；b)将经步骤a)处理的基片表面进行硅烷化；c)将经步骤b)处理的基片表面进行偶联化；d)将名称为TP的单链DNA探针固定在经步骤c)处理的基片表面，所述固定的步骤如下：将所述经步骤c)处理的基片在名称为TP的单链DNA探针溶液中浸泡16～20小时，取出基片，依次进行清洗和干燥；所述TP为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA，所述单链DNA的端部修饰有氨基。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测汞离子的荧光探针芯片的制备方法，包括如下步骤：a)将基片表面的羟基进行活化；b)将经步骤a)处理的基片表面进行硅烷化；c)将经步骤b)处理的基片表面进行偶联化；d)将名称为TP的单链DNA探针固定在经步骤c)处理的基片表面，所述固定的步骤如下：将所述经步骤c)处理的基片在名称为TP的单链DNA探针溶液中浸泡16～20小时，取出基片，依次进行清洗和干燥；所述TP为含有聚脱氧胸苷酸的单链DNA，所述单链DNA的端部修饰有氨基。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b)中，所述硅烷化的步骤如下：将经步骤a)处理的基片浸泡于硅烷化剂溶液中，室温静置10～60min，取出基片进行洗涤和干燥，在130℃～200℃下烘烤1～12h，得到表面硅烷化的基片；和/或，所述硅烷化溶液的溶质为3-氨丙基三乙氧基硅烷，溶剂为无水乙醇或丙酮，体积百分含量为2％～10％。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤d)中，所述名称为TP的单链DNA探针溶液由名称为TP的单链DNA、NaCl和Tris-HCl缓冲液组成，其中，所述名称为TP的单链DNA探针的浓度为200～400nM，所述NaCl的浓度为50～200mM，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10～50mM。4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述聚脱氧胸苷酸中脱氧胸苷酸的个数为14～18，优选为16。5.权利要求1-4中任一项所述的制备方法制备得到的荧光探针芯片。6.一种用于检测汞离子的生物传感器，其特征在于：它包括权利要求5所述的荧光探针芯...

【专利技术属性】
技术研发人员：何苗，韩世同，施汉昌，周小红，汪用志，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11