HLA-A0201限制性抗Her2-neu抗原特异性CTL的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术开发与应用研究领域，公开了HLA-A0201限制性抗Her2-neu抗原特异性CTL的制备方法。该方法通过单采收集外周单个核细胞，富集纯化CD8+T淋巴细胞；用负载HLA-A0201限制性Her2-neu抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，用rhIL-2和rhIL-7促进T细胞生长；用Tetramer标记法和流式细胞分选术纯化目标CTL；用抗人CD3单抗和IL-2刺激目标CTL生长；加γ射线辐照后自体PBMC增强目标CTL的活化；加rhIL-15培育扩增，收集鉴定。本方法制备的目标CTL具备高纯度，高增殖能力，高杀伤活性，高比例CTL-CM，用于肿瘤等免疫治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术开发与应用研究领域，涉及HLA-A0201限制性抗Her2-neu抗原特异性CTL制备方法。
技术介绍
一、肿瘤治疗的困境与机会恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIHRosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注(3×1010-11)，另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2(IL-2)(10万IU/kg，q8h)，因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素γ(IFN-γ)、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体(Mouseanti-HumanCD3mAb)共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。树突状细胞(DCs)是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APC)，其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子(MHCI类和MHCⅡ类分子)，免疫共刺激分子(CD80、CD83、CD86、CD40等)。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8(IL-8)、干扰素α(IFN-α)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，增强机体非特异性免疫应答(天然免疫)，故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者RalphSteinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。三、Her2-neu在肿瘤免疫治疗中的作用Her2-neu是一种原癌基因，编码产物为185kD的跨膜糖蛋白p185，主要包括胞外区、跨膜区和胞内区三部分，其中胞外区富含半胱氨酸，含2个配体结合域；跨膜区起锚定作用；胞内区具有内在酪氨酸激酶活性，且含自身酪氨酸磷酸化位点。Her2-neu原癌基因通过扩增或转录异常而表达，也可通过基因突变被激活，与多种上皮细胞起源的肿瘤发生关系密切。在多种恶性肿瘤组织中存在扩增和p185的高表达状态。1998年美国FDA批准人源化的重组Her2单克隆抗体Herceptin应用于临床，治疗有Her2-neu基因扩增和过表达的乳腺癌患者；2010年欧盟又批准Herceptin用于Her2阳性胃癌患者的治疗，同年10月，美国FDA也批准Herceptin用于治疗晚期胃癌。但Herceptin对于Her2-neu+++患者的临床有效率只有20-30％左右，使用初期疗效良好，长期使用就会产生耐药现象(抗体中和)，且价格比较昂贵，一年的治疗费用在30万左右。2003年美国FDA批准Her2-neu信号转导抑制剂Iressa(吉非替尼)用于Her2高表达的非小细胞肺癌患者。但肿瘤细胞存在多条信号通路的异常激活，因此限制了分子靶向药物的临床疗效。因此，开发新型针对Her2/neu靶点的药物势在必行。抗Her2/neu特异性CTL的开发是一种发展方向。四、CTL作用机理1、机体T细胞免疫反应过程机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体(TCR)特异识别不同的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肽)，被活化为具有杀灭靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。CTL免疫应答大致分四个阶段：(1)抗原识别：APC通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤细胞)；(2)抗原加工与递呈：抗原经APC消化、裂解成多肽分子，后者与APC胞内丰富的MHC-Ⅰ类或Ⅱ类分子结合分别形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽复合物，并被转运至APC表面；(3)T细胞激活(双信号学说)：APC与T细胞相遇，T细胞通过自身TCR识别APC递呈的MHC-I/II-多肽复合物，其中CD8+T细胞识别MHC-I-多肽复合物，CD4+T细胞识别MHC-II-多肽复合物，T细胞接受了抗原的刺激信号(第一信号)加上免疫共刺激信号(第二信号)开始活化，具有细胞毒性作用即CTL；(4)靶细胞杀灭：活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原表达细胞后进行杀伤和清除。但，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数量甚少，不足以与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀灭，将可以防止肿瘤的复发和转移。2、CTL表型与功能差异根据CTL表面分子的表达种类可分为两型：中央记忆型CTL(CTL-CM)和效应记忆型CTL(CTL-EM)。Klebanoff等研究发现：表型分析为CD3+CD45RO+CD62L+CCR7+的CTL-CM具有更强的抗肿瘤能力；Johnson等比较了MART-1TCR基因修饰的CTL-CM和CTL-EM，结果发现前者消退恶性黑色素瘤细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
HLA‑A0201限制性抗Her2‑neu抗原特异性CTL制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：a.CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化：单采收集外周单个核细胞作为CTL前体细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从收集外周单个核细胞中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞；b.目标CTL诱导与第一轮扩增：用负载HLA‑A0201限制性MUC1抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，同时加入rhIL‑2和rhIL‑7两种细胞因子联合促进T细胞生长；第二周再重复刺激一次，完成第一轮扩增；c.目标CTL纯化方法：采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL，即选择Tetramer+CD8+T淋巴细胞；d.目标CTL第二轮扩增：采用固相包被的anti‑human‑CD3mAb和rhIL‑2刺激目标CTL的生长；加入经γ射线辐照后的自体外周单个核细胞增强对目标CTL的活化；加入rhIL‑15继续培育，完成第二轮扩增，收集鉴定。

【技术特征摘要】
1.HLA-A0201限制性抗Her2-neu抗原特异性CTL制备方法，其特征在于该方法包
括下列步骤：
a.CTL前体细胞来源细胞的富集与纯化：
单采收集外周单个核细胞作为CTL前体细胞来源；采用临床级阴性磁珠分离法，从
收集外周单个核细胞中富集、纯化CTL前体细胞即CD8+T淋巴细胞；
b.目标CTL诱导与第一轮扩增：
用负载HLA-A0201限制性MUC1抗原多肽的成熟树突状细胞刺激CD8+T淋巴细胞，
同时加入rhIL-2和rhIL-7两种细胞因子联合促进T细胞生长；第二周再重复刺激一次，
完成第一轮扩增；
c.目标CTL纯化方法：
采用Tetramer标记方法和流式细胞分选术纯化目标CTL，即选择Tetramer+CD8+T
淋巴细胞；
d.目标CTL第二轮扩增：
采用固相包被的anti-human-CD3mAb和rhIL-2刺激目标CTL的生长；加入经γ射线
辐照后的自体外周单个核细胞增强对目标CTL的活化；加入rhIL-15继续培育，完成第
二轮扩增，收集鉴定。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中HLA-A0201限制性MUC1
抗原多肽长度9-15个氨基酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的HLA-A0201限制性MUC1
抗原多肽序列如SEQIDNo.1所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中负载HLA-A0201限制性
MUC1抗原多肽的成熟树突状细胞是通过下列方法制备得到的：将外周单个核细胞贴壁
后加入含rhGM-CSF、rhIFNα、灭活的混合正常人AB和RPMI1640培养基培养三天，收
获DC再加入目标抗原孵育...

【专利技术属性】
技术研发人员：时宏珍，
申请(专利权)人：时宏珍，
类型：发明
国别省市：江苏;32