基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，为嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT，其体外构建的方法，构建的载体petduet-CTB和pet22b-EGFP-CTA2-TAT；然后导入宿主菌，纯化或复性，然后再体外组装AB5结构嵌合蛋白，本方法得到的蛋白纯净度高，并且更稳定，重复性强，并且细菌表达无负担，可快速获得蛋白原料，与GM1结合的高度活性，有更高效的穿膜能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白及其体外构建方法和应用。
技术介绍
构建一种载体来协助诸如大蛋白质类药物高效、低毒、无创伤地穿过血脑屏障来治疗中枢神经系统病症是目前研究的热点。人体免疫缺陷病毒HIV反式激活因子TAT，是一种富含大量阳离子的短肽，目前研究表明，TAT与目标蛋白基因融合后形成的融合蛋白，能够高效、快速、低剂量、无创伤地进入细胞，目前研究表明，但TAT的融合蛋白能在100ug/ml的剂量下能于1小时内进入细胞，并且在细胞内的蛋白分布率达70％以上。因此，TAT融合蛋白显著改善目标蛋白跨膜能力已经毋庸置疑。天然的霍乱毒素(CT)分子由两个部分组成(A和B)，B作为载体的作用，天然的结构为五聚体，其五聚体能与鼻腔内的神经节苷脂GM1结合而并不进入细胞。A亚单位利用B亚单位五聚体中间的小孔，进入细胞，并于细胞体内水解成A1和A2部分，A1和细胞内辅酶作用，干扰细胞信号，使细胞内大量盐离子外输，进而导致机体缺水，引起腹泄甚至死亡。研究表明，与B亚基作用形成天然霍乱毒素的为A2部分，A2与B之间通过亲疏水性的作用，紧密排列在一起，进而引导A1部分进入细胞，并致病。结合CT的分子结构，用EGFP替换A1部分，并加以TAT修饰，使EGFP通过B亚单位进入细胞后，能够继续穿膜，直接穿过血脑屏障，最终，构建获得一种嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT.为了解决这一难题。目前有专利报道通过将CTB和EGFP-CTA2-TAT共转化到同一宿主菌里，通过双抗性筛选嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT。然而，事实是CTB具有五对二硫键，非常容易形成包涵体，上清中无法通过WESTERNBLOT和ELISA的方法检测出CTB的五聚体单位。并且在操作过程中发现，CTB的包涵体的过表达，还会影响EGFP-CTA2-TAT蛋白上清的表达量，双质粒共转化会造成宿舍菌内部负荷过重，导致细菌难长、不表达外源蛋白甚至直接死亡。形成嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT，并使其保持荧光，穿膜活性，更是难上加难。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种获得一种新型的嵌合蛋白，并高度保持其生物活性。该嵌合蛋白能与鼻腔处的神经结苷脂受体结合，通过滴鼻给药的方式，将蛋白EGFP-CTA2-TAT以无创的方式经由鼻腔处进入体内。在生物体内，TAT与CTA2的KDEL序列协同作作，大大提高EGFP穿膜的能力，使EGFP能够顺利穿过血脑屏障，并定位于脑部，以达到高效治疗脑部等神经中枢性疾病。当载体上的EGFP(约26kd)替换为大小与之相类似的药物蛋白，即发挥了本载体递药的作用，该载体未来很有可能成为脑部疾病患者的良药。本专利技术通过以下技术方案来实现：基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，为CTB5/EGFP-CTA2-TAT，为CTB5以及EGFP-CTA2-TAT嵌合组装而成。其中，CTB5的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。EGFP-CTA2-TAT的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其步骤如下：S1、基因克隆与表达采用BamHI/HindIII双酶切的方法，将编码CTB的基因克隆到双基因表达载体petduet-1的多克隆位点1的位置，构建的载体命名为petduet-CTB；将编码有EGFP-CTA-TAT的基因克隆到表达载体pet22b(+)中，并去除其信号肽，克隆时选用的酶切位点为NdeI和XhoI，构建的载体命名为pet22b-EGFP-CTA2-TAT；S2、EGFP-CTA2-TAT可溶性蛋白表达与纯化质粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT导入宿主菌，即大肠杆菌BL21(DE3)中，并实现表达；pet22b-EGFP-CTA2-TAT在大肠杆菌BL21(DE3)系统中以可溶性形式表达，最终经由Ni-NTA纯化得到电泳纯的产品；S3、霍乱毒素B亚单位包涵体蛋白纯化及复性质粒petduet-CTB导入宿主菌BL21(DE3)中，并实现表达，表达产物为包涵体，包涵体通过洗涤，去除表面杂质后，重新溶于梯度浓度的尿素中，通过电泳筛选纯的CTB单体，CTB单体经梯度透析复性形成稳定的CTB5；S4、体外组装AB5结构嵌合蛋白纯化的CTB5与EGFP-CTA2-TAT通过超滤除去大部分的盐离子后，按CTB5:EGFP-CTA2-TAT的质量比为5：1至8：！的比例投入反应容器中，通过加入柠檬酸使混合物的pH值为2.3-3.0之间，20s后迅速加入EDTA二钠调节PH至8.5.室温静置至少1小时，直至荧光逐渐恢复，即可。进一步地，设计引物如下：CGCGGATCCAACACCTCAAAATATTACTGATTT和CAGCCAACTCAGCTTCCTT，用于从pet28a-CTB中扩增目标基因序列CTB即编码CTB的基因。进一步地，设计引物如下：CGGAATTCCATATGGTGAGCAAGG和CCGCTCGAGCTGTGGTGGAC，用于从合成的基因序列中扩增具有酶切位点NdeI/XhoI的基因序列EGFP-CTA2-TAT，即编码有EGFP-CTA-TAT的基因。进一步地，为方便纯化，保留载体petduet-CTB上原有的组氨酸标签。进一步地，为方便纯化，保留载体pet22b-EGFP-CTA2-TAT上原有的组氨酸标签。进一步地，EGFP-CTA2-TAT的基因序列之间用连接肽作了相应的修饰。嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT用于肿瘤的治疗。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果是：1.体外组装干扰少，实验表明，得到的蛋白纯净度高，并且更稳定。2.体外组装区别于共转化到同一宿主菌的是，重复性强，并且细菌表达无负担，可快速获得蛋白原料。3.本专利技术首次验证了嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT与GM1的结合活性，并且结果表明其保持与GM1结合的高度活性。4.本专利技术首次用HPLC的方法来验证CTB5/EGFP-CTA2-TAT是否形成，结果表明，CTB5/EGFP-CTA2-TAT能够经由酸碱度调节形成。5.本专利技术区别于共转化的是，单独获得了蛋白EGFP-CTA2-TAT与CTB5.并且，CTB5有肿瘤杀伤力，EGFP-CTA2-TAT有相比于EGFP-TAT更高效的穿膜能力，在剂量为5ug下，可于15min内进入细胞，并且对细胞无杀伤力，相较于文献报导的EGFP-TAT,100ug,1小时，有显著的剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，其特征在于，为CTB5/EGFP‑CTA2‑TAT，为CTB5以及EGFP‑CTA2‑TAT嵌合组装而成。
【技术特征摘要】
1.基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，其特征在于，为CTB5/EGFP-CTA2-TAT，为CTB5以
及EGFP-CTA2-TAT嵌合组装而成。
2.根据权利要求1所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，其特征在于，CTB5的氨基
酸序列为SEQIDNO：1所示。
3.根据权利要求1所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白，其特征在于，EGFP-CTA2-
TAT的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。
4.权利要求1～3所述的基于霍乱毒素CT结构递药载体蛋白的体外构建的方法，其特征
在于，其步骤如下：
S1、基因克隆与表达
采用BamHI/HindIII双酶切的方法，将编码CTB的基因克隆到双基因表达载体petduet-
1的多克隆位点1的位置，构建的载体命名为petduet-CTB；
将编码有EGFP-CTA-TAT的基因克隆到表达载体pet22b(+)中，并去除其信号肽，克隆时
选用的酶切位点为NdeI和XhoI，构建的载体命名为pet22b-EGFP-CTA2-TAT；S2、EGFP-CTA2-TAT可溶性蛋白表达与纯化
质粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT导入宿主菌，即大肠杆菌BL21(DE3)中，并实现表达；
pet22b-EGFP-CTA2-TAT在大肠杆菌BL21(DE3)系统中以可溶性形式表达，最终经由Ni-NTA
纯化得到电泳级纯的产品。
S3、霍乱毒素B亚单位包涵体蛋白纯化及复性
质粒petduet-CTB导入宿主菌BL21(DE3)中，并实现表达，表达产物为包涵体，包涵体通
过洗涤，去除表面杂质后，重新溶于梯度浓度的尿素中，通过电泳筛选纯的CTB单体，CTB单
体经梯度透析复性形成稳定的CTB5；
S...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑希，林卫萍，王华倩，杜志云，张焜，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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