检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用，其正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'。本发明专利技术基于桑丁香假单胞菌区别于其他丁香假单胞菌致病变种的特异性致病基因片段(hrpZ gene)设计和筛选了一对特异性引物对Psm240F/Psm434R，同时利用该引物对建立一种桑丁香假单胞菌的荧光定量PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高的特点，且大大缩短了检测所需时间，从样品处理至得出结果只需4～5h。因此该方法适用于桑疫病的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为一种检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用，专用于检测桑丁香假单胞菌，属于农作物病害诊断与防治

技术介绍
丁香假单胞菌细菌性病害(Pseudomonassyringaepathovars)是世界上分布最广、危害最严重且最难防治的重大细菌性病害，于2012年被列为十大细菌性病害之首(Mansfield,J.etal,2012,13(6),614-629)。此病广泛流行于热带、亚热带及温带地区，有40多个类型的致病变种，可对包括草本、灌木和乔本在内的200多种植物造成危害(Rudolph,K.W,1995,1,47-138)。该病害可造成农作物最高减产90％，每年在全球范围内造成直接经济损失高达350亿美元，引起了人们的广泛关注。桑疫病(mulberrybacterialblight)是由桑丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.mori)引起的，桑丁香假单胞菌属于丁香假单胞菌的一个致病变种。桑疫病的发生主要是其病原菌通过植株叶片气孔进入植株体内，并在植物维管束中进行大量繁殖，导致导管阻塞，植物水分运输受阻，同时致病菌还不断合成分泌大量的毒素蛋白破坏植株组织结构，使得植株最终表现出萎缩及腐烂症状，而植株的病变部位主要出现在植株的顶端或者嫩梢，故桑疫病又称“烂头病”。该病因发病周期短，蔓延态势严峻，已成为制约蚕桑产业可持续发展的重要因素。桑疫病一旦发生，很难进行有效的根治，而处在潜伏期的植物组织从外观上很难与正常组织分开，因此，快速有效的早期诊断对于控制桑疫病的蔓延和避免重大损失的发生具有重要意义。快速、精确的早期病原菌检测手段是提高病害检测效率的基础，也是降低生物防治成本的前提。对于丁香假单胞菌的检测，目前最主要的有选择性培养基和分子生物学的方法。选择性培养基最早是由Mohan,S.K.等于1987年报道利用一种改良的KBC琼脂培养基平板法快速检测紫丁香和菜豆致病变种的丁香假单胞菌。Goszczynska,T.等在前人的基础上作出改进，于1998年指出利用MT培养基可以进行丁香假单胞菌与其他病原菌的区分，从而达到检测丁香假单胞菌的目的。目前使用的分离筛选丁香假单胞菌的培养基大多也是基于以上几种培养基或改良而来的。指示植物检测法是检测病原菌的方法之一，但由于周期长，并且受季节性限制，因此该法不能广泛应用于快速检测丁香假单胞菌。分子生物学方法主要包括普通PCR法及荧光定量PCR法。2005年，Zaccardelli,M.等根据番茄丁香假单胞菌的致病基因hrpZ为目的片段设计特异性引物利用PCR扩增对番茄丁香假单胞菌进行快速检测。ReesGeorge,J.等于2010年依据16S-23SrDNA序列的间隔区设计出特异性的引物对猕猴桃丁香假单胞菌进行PCR检测。随着病原菌检测手段的不断提高，2014年，Gallelli,A.等在普通PCR检测方法的基础上进行改进，利用荧光定量PCR方法对猕猴桃丁香假单胞菌进行快速检测。荧光定量PCR方法近年来凭借其灵敏度高、可靠性强、稳健性好的三大优点而广泛应用于食物病原菌及部分植物病原菌的快速检测，具有良好的应用前景。然而，截止目前为止，尚未有文献报道关于应用荧光定量PCR方法进行桑疫病病原菌的快速检测。因此本专利技术尝试使用荧光定量PCR方法对桑疫病病原菌进行绝对定量，不但提高了检测的特异性和灵敏度，而且可避免生产上对桑树病害的误判，同时也降低了病原菌检测所需的时间，为桑疫病的早期诊断和及早防治打下了基础。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术通过设计用于检测桑丁香假单胞致病菌的特异性引物而建立一种灵敏、可靠、稳定的检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用，从而克服桑疫病病原菌传统检测方法和半定量PCR检测方法的不足。技术方案：检测桑丁香假单胞菌的引物，正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'。所述的引物在荧光定量PCR检测中的应用，包括以下步骤：1)利用KB液体培养基培养病原菌，制备病原菌菌悬液，同时采用Biospin细菌全基因组DNA提取试剂盒(BioerTechnologyCo.,Ltd.)提取病原菌总DNA，制备菌液和DNA标准样品；2)特异性引物设计，对致病性的桑丁香假单胞菌设计了其特异性的引物对Psm240F/Psm434R，所述引物对为：正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'；3)实时荧光定量PCR检测方法反应体系为：20μL反应体系中，包含10μLSYBRPremixExTaqⅡ(TliRNaseHPlus)(2×)，0.8μLPsm240F10μM，0.8μLPsm434R10μM，0.4μLROXReferenceDye(50×)，2.0μL模板为标准病原菌菌悬液和DNA稀释液或待测样品的菌悬液，6μL双蒸水；4)实时荧光定量PCR检测方法扩增程序为：两步法扩增程序：第一步：95℃预变性10min；第二步：95℃变性15s，60℃延伸31s，反应共计45个循环，PCR完成后，按0.1℃/s升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；5)取步骤1)中得到的病原菌菌悬液经平板计数法定量并进行梯度稀释，稀释成9个不同的浓度梯度：1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，1×105cfu/mL，1×104cfu/mL，1×103cfu/mL，1×102cfu/mL，同时，取步骤1)中病原菌的全基因组DNA经ND-1000V3.7.1(ThermoSCIENTIFIC，USA)定量并10倍梯度稀释，稀释成6个不同的浓度梯度：6.0ng/μL，6.0×10-1ng/μL，6.0×10-2ng/μL，6.0×10-3ng/μL，6.0×10-4ng/μL，6.0×10-5ng/μL，以不同浓度梯度的菌悬液和DNA为模板按照上述PCR反应体系和扩增程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值(Ct)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。桑树桑疫病的动态监测试剂盒，含有上述的引物。桑树植株带菌及带菌量的检测试剂盒，含有上述的引物。有益效果本专利技术基于桑丁香假单胞菌区别于其他丁香假单胞菌致病变种的特异性致病基因片段(hrpZgene)设计和筛选了一对特异性引本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测桑丁香假单胞菌的引物，其特征在于正义引物Psm240F序列为：5'‑AAGGTAACGGGGCTAAT‑3'，反义引物Psm434R序列为：5'‑GCTGTTGACCGATGATAT‑3'。

【技术特征摘要】
1.检测桑丁香假单胞菌的引物，其特征在于正义引物Psm240F序列为：
5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'。
2.权利要求1所述的引物在荧光定量PCR检测中的应用，其特征在于包括以下步骤：
1)利用KB液体培养基培养病原菌，制备病原菌菌悬液，同时采用Biospin细菌全基
因组DNA提取试剂盒提取病原菌总DNA，制备菌液和DNA标准样品；
2)特异性引物设计，对致病性的桑丁香假单胞菌设计了其特异性的引物对
Psm240F/Psm434R，所述引物对为：正义引物Psm240F序列为：
5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'；
3)实时荧光定量PCR检测方法反应体系为：20μL反应体系中，包含10μLSYBRPremix
ExTaqⅡ(TliRNaseHPlus)(2×)，0.8μLPsm240F10μM，0.8μLPsm434R10μM，0.4μLROX
ReferenceDye(50×)，2.0μL模板为标准病原菌菌悬液和DNA稀释液或待测样品的菌悬液，6
μL双蒸水；
4)实时荧光定量PCR检测方法扩增程序为：两步法扩增程序：第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴福安，包奇，周雨，曹梦琪，王俊，盛晟，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32