一种检测TPMT基因*2多态性的引物与方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测TPMT基因*2多态性的引物与方法。本发明专利技术提供的检测TPMT基因*2多态性的引物包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物。本发明专利技术提供的检测TPMT基因*2多态性的引物与方法可以实现TPMT基因*2多态性的特异性检测，检测特异性和灵敏度高，准确性和精密性好，可用于临床检测TPMT基因*2多态性，检测结果可用于嘌呤类化疗药物个体化用药临床指导。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种检测TPMT基因*2多态性的引物与方法。
技术介绍
巯嘌呤类药物属于抑制嘌呤合成途径的细胞周期特异性药物，能竞争性抑制次黄嘌呤转变，阻碍DNA合成，抑制淋巴细胞增殖，是临床上常用于白血病、实体肿瘤的抗癌治疗和器官移植后的免疫抑制治疗的药物。在急性淋巴细胞白血病（ALL）的治疗和改善预后中，巯嘌呤类药物发挥了重要的作用，已有研究显示ALL治疗方案中含巯嘌呤的维持治疗是减少复发和提高无病生存率的重要环节。同时，现有研究也表明，治疗ALL的抗嘌呤代谢药物―6-巯基嘌呤(6-MP)和6-巯代鸟嘌呤(6-TG)等均是无内在生物活性的药物，必须通过体内一系列代谢后才能发挥其抗白血病效应。巯嘌呤甲基转移酶（TPMT基因编码）是巯嘌呤代谢过程的关键酶之一，能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基的供体和底物结合，特异地催化杂环类和芳香类化合物苯环6-位硫原子甲基化而使其转变成具有生物活性的中间产物。巯嘌呤甲基转移酶活性缺乏者，巯嘌呤转化率降低，使用标准剂量的巯嘌呤治疗可能会导致严重的毒副反应。关于TPMT的研究结果发现，巯嘌呤甲基转移酶活性降低或缺乏与其等位基因多态性密切相关，目前已发现18种可能会引起巯嘌呤甲基转移酶活性降低的TPMT单核苷酸多态性（SNPs）位点，对不同人种进行的研究发现，TPMT基因*2、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C这3个TPMT基因多态性位点最为常见，其余的则比较罕见。TPMT活性缺乏的患者服用标准计量巯嘌呤后药物在体内代谢障碍，将会导致较为严重的巯嘌呤相关毒副作用，因此使用巯嘌呤治疗相关疾病的过程中，建议筛查使用巯嘌呤患者的TPMT基因类型，以指导临床巯嘌呤药物剂量的调整。中国专利CN101333560公开了一种嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，可用于检测TPMT基因的TPMT基因*2、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C多态性位点，但基因芯片的设计成本高，检测费用昂贵，而且其敏感度不高，检测结果的可重复性差。现有技术中缺少一种检测特异性和灵敏度高、准确性和精密性好、可实现TPMT基因*2多态性检测的检测引物及其方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种检测TPMT基因*2多态性的引物与方法，具有检测特异性和灵敏度高，准确性和精密性好等优点，实现了TPMT基因*2多态性的检测。本专利技术检测的位点为TPMT基因*2(NM_000367.3:c.238G>C，rs1800462)。本专利技术提供一种检测TPMT基因*2多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物为上游引物5’-GAAACCCTATGAACCTGAATTC-3’(SEQIDNO.1)和下游引物5’-TTCCACACCAACTACACTGT-3’(SEQIDNO.2)；所述SNaPshotPCR引物为5’-GTATGATTTTATGCAGGTTT-3’(SEQIDNO.3)。采用上述技术方案，本专利技术提供的检测TPMT基因*2多态性的引物，可以实现TPMT基因*2多态性的特异性检测，准确性好。相应地，本专利技术还提供一种检测TPMT基因*2多态性的方法，包括如下步骤：S1、提取DNA样品；S2、以步骤S1所述的DNA样本为模板，利用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化，；S3、以步骤S2所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化；S4、采用毛细管电泳技术对步骤S3所述的纯化后的SNaPshotPCR扩增产物进行检测，并对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。优选地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。优选地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：98℃预变性3min，98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行29个循环，最后72℃延伸5min，结束后25℃保温。优选地，所述步骤S3中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括：96℃变性10s，55℃退火5s，60℃延伸30s，进行25个循环，结束后4℃保温。优选地，所述步骤S4中，采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。此外，本专利技术还提供检测TPMT基因*2多态性的引物在制备检测TPMT基因*2多态性试剂中的用途。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测TPMT基因*2多态性的引物，该引物的特异性好，可实现TPMT基因*2多态性特异性检测，准确性好，检测效率高。此外，本专利技术还提供了一种检测TPMT基因*2多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物，实现TPMT基因*2多态性的检测，具有特异性好、灵敏度高、准确性和精密性好等优点，检测结果可用于嘌呤类化疗药物个体化用药的临床指导。附图说明图1本专利技术提供的TPMT基因*2引物的部分扩增片段。图2本专利技术提供的TPMT基因*2引物扩增产物的部分测序图。图3样品的TPMT基因*2检测结果图。具体实施方式以下内容是结合具体的优选实施方式对本专利技术所作的进一步详细说明，不能认定本专利技术的具体实施只局限于这些说明。对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本专利技术的保护范围。实施例一引物专利技术人针对TPMT基因*2的多态性位点设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物。本专利技术提供的引物如表1所示。本专利技术提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。实施例二引物的特异性将本专利技术提供的TPMT基因*2引物于UCSC中进行Blast，结果如下：TPMT基因*2扩增片段位于chr6：18143923-18144086，长度为164bp。TPMT基因*2特异引物的扩增片段及基因组位置如图1所示，引物的扩增片段覆盖了相应的检测位点TPMT基因*2，无其它同源基因。使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品DNA进行扩增及Sanger测序，部分测序结果如图2所示。测序结果显示，引物扩增片段与TPMT基因*2参考序列吻合。TPMT基因*2参考序列号为TPMT:NG_012137.2;NM_000367.3。使用表1中SNaPshotPCR引物，SNaPs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测TPMT基因*2多态性的引物，其特征在于，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物为上游引物5’‑GAAACCCTATGAACCTGAATTC‑3’和下游引物5’‑TTCCACACCAACTACACTGT‑3’；所述SNaPshot PCR引物为5’‑GTATGATTTTATGCAGGTTT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测TPMT基因*2多态性的引物，其特征在于，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR
引物；所述PCR扩增引物为上游引物5’-GAAACCCTATGAACCTGAATTC-3’和下游引物5’-
TTCCACACCAACTACACTGT-3’；所述SNaPshotPCR引物为5’-GTATGATTTTATGCAGGTTT-3’。
2.一种检测TPMT基因*2多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取DNA样品；
S2、以步骤S1所述的DNA样本为模板，利用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重
PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3、以步骤S2所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1中所述的SNaPshot
PCR引物进行SNaPshotPCR扩增，并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化；
S4、采用毛细管电泳技术对步骤S3所述的纯化后的SNaPshotPCR扩增产物进行检测，
并对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡昌明，梁耀铭，于世辉，赵薇薇，燕启江，郭周萍，
申请(专利权)人：广州金域检测科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44