本发明专利技术提供了一种利用幼胚拯救获得八仙花远缘杂种的方法。选择不耐寒的八仙花 “钻石”（Hydrangea macrophylla ‘Diamond’）做母本，耐寒的树绣球“安娜贝拉”（H.arborescens ‘Annabelle’）做父本，进行种间杂交，采用子房培养手段进行幼胚拯救，并对获得的杂种后代材料进行形态学鉴定和SSR鉴定。该发明专利技术避免远缘杂种由于不亲和性导致胚早衰，通过组培的方式可以获得大量的种间杂交后代，实现了八仙花种间远缘杂交，创造一批抗寒性较强且观赏价值高的新种质，大大缩短八仙花的育种周期。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用受精后的幼胚离体培养获得八仙花远缘杂交种的方法，属于生物技术育种领域。
技术介绍
八仙花（Hydrangeamacrophylla）又名绣球、紫阳花，为虎耳草科八仙花属植物。绣球属(Hydrangea)植物全世界约有85个种，我国绣球属植物共有47种和11变种，除南部海南、东北部黑龙江、吉林，西北部新疆等省区外，全国各地均有分布，尤以西南部至东南部种类最多。八仙花原产中国和日本，喜温暖、湿润和半阴环境，不甚耐寒。夏季酷暑忌烈日直晒，否则叶易焦枯黄，不适宜过分干燥，喜生于含腐殖质丰富、湿润、排水良好的轻壤土上。绣球属植物多为灌木，花序、花型、花色丰富是优良的观赏花卉。八仙花叶大而具有光泽，既可观花又可观叶，其适应性强，具有耐寒(在南京地区一些种类的绿期可达300d以上)、抗性强、耐荫等特性，很少感染病虫害等优点。绣球属植物对土壤的酸碱度非常敏感，土壤呈酸性时，开的花为蓝色，随着土壤pH值升高，其花色逐渐由蓝变红，因而，通过调节土壤的pH值可改变八仙花的花色。八仙花被广泛应用于公园、庭院等景观中，配置方式多样，令人驻足流连。近几年，微型盆栽和切花八仙花在国内外市场广受欢迎，逐渐成为花市上新宠，欧美、日本等国对八仙花花卉资源及育种的研究较早，培育出了很多的园艺栽培品种。我国园林中应用较多的仍旧是20世纪欧洲选育的八仙花品种，因此绣球属植物的野生资源开发利用与新品种选育研究具有十分广阔的前景。八仙花在气候适宜地区是极优良的花灌木，若冬季气温不低于15℃，叶丛油亮碧绿，可达到三季有花、四季常青。但由于八仙花大多数品种耐寒性较差，其分布和应用范围受到限制。为了更好地促进八仙花的园林生产及应用，将这种美丽多变的材料引入到北方地区，甚至让其在华北地区露地过冬，需要培育出耐寒且美观的八仙花品种。我国已经从美国引入了耐寒绣球品种——树绣球，其形态为：落叶灌木或半灌木，高2～3m。叶纸质，交互对生，卵形或卵圆形，缘有锯齿，两面有毛。聚伞花序，外围有大型白色不孕花，中央为可孕花，花期5～7月。该种有2个园艺品种，其中之一是我国南北各地广泛栽培的‘安娜贝拉’（Hydrangeaarborescens‘Annabelle’），俗称“雪山八仙花”，即本试验的父本品种，是最耐寒的绣球品种之一。其花序全部由大型白色不孕花组成，初绽绿色，渐次转白，直径可达20cm以上；另一个园艺品种是大花光叶八仙花（H.arborescens'Grandiflora'），花型接近于雪球（snowballs）。对照USDA的野生树绣球‘安娜贝拉’分布图，这一耐寒品种分布在北美洲的东北部。其分布地植物的耐受最低温度达到-31.7℃，这一数据表明该品种可以在华北地区安全露地过冬。‘安娜贝拉’极强的耐寒能力成为我们选择其作为亲本的理由。八仙花新品种的培育多数是通过种内杂交实现的，种间杂交属于远缘杂交，自然状态下由于易败育而无法获得杂交后代。杂种胚的挽救培养技术作为组织培养的一个重要领域己有近百年的历史，杂交子房、胚珠和杂交幼胚的离体培养，是目前克服受精后发育障碍的有效方法，在植物育种工作中发挥着极为重要的作用，己广泛运用于水稻、小麦、玉米等粮食作物的育种工作中。因此利用幼胚拯救技术获得八仙花杂种后代，是培育观赏价值高且抗寒性强的八仙花新品种的关键所在。
技术实现思路
为克服上述问题，本专利技术提供了一种离体培养子房获得八仙花种间杂种的方法，该方法能够提高八仙花种间杂交的杂种成活率，缩短育种周期。本专利技术通过下列技术方案实现：一种离体培养子房获得八仙花种间杂种的方法，包括以下步骤：A、子房消毒：将授粉后60-75天的未完全发育子房切割下来，在0-8℃温度条件下存放24-72小时后取出，用浓度为75%的酒精对其表面擦拭2-3次，流水冲洗2-6小时，带到超净工作台上。用75%的酒精浸泡30秒，0.05-0.1%升汞溶液中浸泡8-15min，用无菌水清洗5-6遍，选取膨大的子房，用无菌刀片切去子房基部；B、接种：在无菌条件下，将灭菌后切去基部的子房接种到1/2MS+6-BA0.5-2mg/L+NAA0.1-1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，灭菌前PH调整到5.8-6.0。培养温度为21-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间12-14h/d，空气湿度70-85%，培养30-45天后萌发率达到30-40%；C、增殖培养：将萌发的幼胚接种到1/2MS+6-BA1mg/L+NAA0.5-1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，灭菌前PH调整到5.8-6.0。培养温度为21-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间12-14h/d，空气湿度70-85%的条件下进行幼苗的增殖培养，30-45天转接一次；D、生根培养：将增殖获得的无菌幼苗转接到1/2MS+IBA0-0.5mg/L+AC0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L,灭菌前PH调整到5.8-6.0。培养温度为21-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间12-14h/d，空气湿度70-85%的条件下进行生根培养，30-45天后统计生根率为100%E、杂种鉴定：对获得材料同时进行形态学鉴定和杂种SSR鉴定，其中在形态学鉴定时，对杂种的父母本及后代材料的形态学进行观察和统计，包括：依据英国皇家园艺学会色谱比色，对父母本及开花后代的花色进行比对并记录；每株随机选择三片完全展开的叶片，进行叶长和叶宽的测定，并分别测定叶柄的长度；每株随机选择三个完全盛开的花序，测量其花序的长宽，并记录每个花序的着花数；每个花序随机选择五多单花，测量其单花的长度和宽度；每株随机选择五个花瓣，对花瓣长度和宽度进行测量。其中花色与父母本的花色均不同，叶片长宽比、花瓣长度、宽度、长宽比及花序长宽比介于父母本之间的初步确定为真杂种。在杂种SSR鉴定时，提取亲本及获得的杂交后代的DNA，对获得的DNA质量进行鉴定，然后进行PCR扩增及琼脂凝胶电泳获得扩增谱带，并对PCR产物进行检测，然后使用全自动ABI3730DNA自动测序仪对PCR产物进行STR分型。首先根据SSR引物扩增条带读数结果，扩增结果较清晰反映出有子代发生重组现象；然后通过分析SM匹配系数进行的UPGMA法聚类结果发现无一子代与亲本相似系数为1，即无一子代与亲本完全相同。而各子代之间的相似性系数变化范围在0.47-0.93，体现出各个子代间都存在一定的差异。最后我们可以确定14个杂种子代为真杂种。有益效果：本专利技术提供的利用幼胚拯救获得八仙花种间杂交的方法，与现有技术相比有如下优点和积极效果：（1）本专利技术利用不耐寒的八仙花‘钻石’（Hydrangeamacrophylla‘Diamond’）与耐寒树绣球‘安娜’（Hydrangeaarborescens‘Annabelle’）进行种间杂交，结合幼胚拯救技术进行八仙花种质创新，实现了八仙花种间远缘杂交，创造了一批新种质。（2）本实验选用将授粉后60-75天后获得的子房进行离体培养，此时胚已接近成熟本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用幼胚拯救获得八仙花种间杂种的方法，包括以下步骤：A、子房消毒：将授粉后60‑75天的未完全发育子房切割下来，在0‑8℃温度条件下，存放24‑72小时后取出，用浓度为75%的酒精对其表面擦拭2‑3次，流水冲洗2‑6小时，带到超净工作台上；用75%的酒精浸泡30秒，0.05‑0.1%升汞溶液中浸泡8‑15min，用无菌水清洗5‑6遍，选取膨大的子房，用无菌刀片切去子房基部。
【技术特征摘要】
1.一种利用幼胚拯救获得八仙花种间杂种的方法，包括以下步骤：
A、子房消毒：将授粉后60-75天的未完全发育子房切割下来，在0-8℃温度条件下，存放24-72小时后取出，用浓度为75%的酒精对其表面擦拭2-3次，流水冲洗2-6小时，带到超净工作台上；用75%的酒精浸泡30秒，0.05-0.1%升汞溶液中浸泡8-15min，用无菌水清洗5-6遍，选取膨大的子房，用无菌刀片切去子房基部。
2.B、接种：在无菌条件下，将灭菌后切去基部的子房接种到1/2MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，灭菌前PH调整到5.8-6.0；培养温度为21-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间12-14h/d，空气湿度70-85%，培养30-45天后萌发率达到30-40%。
3.C、增殖培养：将萌发的幼胚接种到1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5-1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，灭菌前PH调整到5.8-6.0；培养温度为21-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间12-14h/d，空气湿度70-85%的条件下进行幼苗的增殖培养，30-45天转接一次。
4.D、生根培养：将增殖获得的无菌幼苗转接到1/2MS+IBA0-0.5mg/L+AC0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，灭菌前PH调整到5.8-6.0；培养温度为21-26℃，光照强度...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨玉勇，
申请(专利权)人：杨玉勇，张启翔，蔡明，
类型：发明
国别省市：云南;53
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