一种植物诱导型启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物诱导型启动子及其应用。通过染色体步移法从盐生植物野大麦基因组中获得了一段1750bp的HbCIPK2启动子序列，利用该启动子序列获得的拟南芥转proHbCIPK2:GUS株系在NaCl不同浓度和不同时间胁迫下均可驱动GUS基因的表达，而且随着胁迫时间和浓度的增加，GUS的表达活性增强；在PEG和ABA胁迫下HbCIPK2启动子驱动GUS基因的诱导表达活性相对较低；但相同的转基因株系在无胁迫处理、低温和高温胁迫下均无GUS基因的表达。本发明专利技术获得的1750bp的DNA序列是一种新型的逆境诱导型启动子，在高盐胁迫下具有较强的启动子活性,可诱导转录因子等调控基因的适量表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物转基因
，具体涉及一种植物诱导型启动子序列及其在植物抗逆调控中的应用。
技术介绍
盐渍化和干旱是制约农业可持续发展的重要环境因素。据统计，全世界103个国家有盐渍化土壤，面积达38,000万公顷，约占全球可耕地面积的10％；我国约有1.4亿亩盐渍化耕地和4亿亩的盐渍化荒地。更为严重的是，因全球气温升高，海平面上升，加之工业污染和农业灌溉、施肥不当等人为因素的影响，次生盐渍化土壤面积还在以每年3％的速度扩展；加上水资源日趋紧张，干旱发生极为频繁，每年因干旱减产粮食100亿公斤以上，直接经济损失达100-200亿元。这“双重威胁”给农业生产带来重大损失。因此，如何在高盐和干旱等逆境条件下最大限度地发挥作物的生产潜力，是我国目前农业生产迫切需要解决的问题。其中培育耐盐、抗旱新品种是解决农作物高盐、干旱胁迫的根本有效途径，而挖掘、研究和利用植物中调控抗逆性的关键基因和重要调控元件是培育耐盐、抗旱新品种的重要手段。植物诱导型启动子可以精细调节植物在受到外界刺激时基因的表达，诱导型启动子的研究一直是植物转录表达调控的热点问题，特别是诱导型启动子在植物抗逆转基因育种中作为关键元件备受关注。目前诱导型启动子主要集中在生物和非生物胁迫诱导启动子方面，包括响应干旱、高盐、高温、冷害、病害和外源ABA胁迫的启动子，其中一些启动子已广泛应用于植物抗逆转基因育种中。比如，拟南芥Rd29启动子已成功应用于抗旱转基因小麦育种；高盐、干旱和ABA诱导启动子OsNCED3、Wsi18已应用于水稻抗逆转基因育种。尽管目前已克隆出一些逆境诱导型启动子，但还是不能满足不同植物不同转基因育种的要求。尤其对于转调控基因作物育种来说，选择诱导表达活性适中的启动子非常重要。所以挖掘和研究新的逆境诱导型启动子，特别是从特殊生境植物筛选克隆逆境诱导活性适中的启动子具有重要价值和意义。蛋白激酶在植物抗逆响应中起重要信号传递作用。其中，CIPK(CBL-interactingproteinkinase,CIPK)蛋白激酶是一类植物所特有的、与钙离子感受器CBLs(calcineurinB-like,CBL)特异作用的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。CBL-CIPK-靶蛋白构成了感知、传递和响应逆境信号的调控通路，是植物逆境调控研究的热点之一。但由于该调控途径存在复杂性、多样性和交叉性，CBL-CIPK所涉及到的调控功能比预期的要复杂的多。迄今为止，已鉴定出的、被广泛认可的响应逆境胁迫的CBL-CIPK调控途径有：响应高盐胁迫的SOS途径、响应低钾胁迫的CBL1/CBL9-CIPK23-AKT1途径、响应高pH胁迫的CBL2-CIPK11-AHA2途径。CIPKs作为植物逆境响应信号调控途径的枢纽，在逆境信号传导中起重要作用。但是不同的CIPK成员可能参与相同的调控途径，相同的CIPK也可能参与不同逆境胁迫响应。到目前为止，除SOS2/AtCIPK24外，在已研究的部分AtCIPKs成员中还未见其他成员参与拟南芥耐盐性调控。迄今，研究的材料大部分局限于模式植物或甜土植物，非特殊种质。一些特殊生境种质材料可能具有解密逆境Ca2+信号的特殊途径，挖掘克隆特殊生境植物信号组分，解析其在逆境胁迫中的作用，对有效利用基因资源改良作物抗逆性具有重要意义。在解析CIPK基因功能的同时，其启动子的功能也备受关注。但是目前报道的大部分CIPK启动子活性均表现为组织特异性，如AtCIPK1启动子、AtCIPK3启动子和AtCIPK9启动子等，而且启动子研究多集中于模式植物，从非模式植物克隆并进行启动子功能分析的报道较少，仅见从芥菜中分离获得的BjSOS2启动子具有逆境诱导表达活性，而且诱导表达活性较强，对于驱动逆境胁迫响应下游基因来说，是一种比较合适的启动子，而对于调控基因(转录因子和信号传导因子)的诱导表达来说，则需要诱导表达活性适中的启动子来驱动。因此，逆境诱导启动子的分离与功能研究具有重要意义。野大麦(Hordeumbrevisubulatum(Trin.)Link)是禾本科大麦属一种多年生兼性盐生的优良牧草，主要分布在西西伯利亚、蒙古和我国东北、华北、新疆、西藏和内蒙等省区，是盐化和碱化草甸草原的建群种，具有显著的耐盐性，是研究植物耐盐生理和耐盐机制的优异资源。但前人只局限在形态、解剖、生理等方面的研究，在野大麦耐盐分子机制和基因克隆方面的研究较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种植物诱导型启动子，该启动子可应用于植物耐盐等抗逆分子机理研究和农作物抗逆转基因育种。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的。1)或2)或3)的DNA分子：1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA分子；2)在高严谨条件下与序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的DNA分子；3)与所述1)或2)的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的DNA分子。DNA分子有关的生物材料，为下述A1)-A6)中的任意一种：A1)含有所述DNA分子的表达盒；A2)含有所述DNA分子的重组载体，或A1)所述表达盒的重组载体；A3)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的重组微生物；A4)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的重组细胞系；A5)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的转基因植物组织；A6)含有所述DNA分子、A1)所述表达盒或A2)所述重组载体的转基因植物器官。所述DNA分子在作为植物诱导型启动子中的应用。进一步的，所述诱导型启动子为逆境诱导型和/或ABA诱导型启动子；所述逆境胁迫为盐胁迫和/或干旱胁迫。所述DNA分子或A1)-A3)中任一所述生物材料在植物体内启动目的基因表达的应用及在培育植物品种中的应用。一种SEQIDNO.1所示的DNA分子的获得方法，包括如下步骤：1)采用CTAB法提取野大麦基因组DNA，2)采用基因组步移法克隆野大麦HbCIPK2启动子区域；步骤2)中进行两轮PCR扩增，分别使用2条反向引物SP1和SP2，所述SP1和SP2引物分别为序列表中SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示的DNA分子。一种培育转基因植物的方法，是将所述DNA分子和目的基因导入植物中，得到所述目的基因受逆境胁迫诱导和/或ABA诱导表达的植物。进一步的，所述的方法包括如下步骤：1)构建以权利要求1所述DNA分子驱动GUS基因的表达载体proHbCIPK2:GUS；2)利用表达载体proHbCIPK2:GUS获得转基因株系。进一步的，所述步骤1)的具体操作方法为：使用引物proHbCIPK2-F、proHbCIPK2-R采用PCR方法扩增所述DNA分子并引入酶切位点PstI和XhoI，测序后插入载体pYBA1121，构建获得表达载体proHbCIPK2:GUS；所述引物proHbCIPK2-F、proHbCIPK2-R分别为序列表中SEQIDNO.4、S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA分子；2）在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的DNA分子；3）与所述1）或2）的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.1）或2）或3）的DNA分子：
1）序列表中SEQIDNO.1所示的DNA分子；
2）在高严谨条件下与序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的DNA分子；
3）与所述1）或2）的核苷酸序列具有65％以上的同一性，且具有启动子活性的DNA分子。
2.与权利要求1所述DNA分子有关的生物材料，为下述A1）-A6）中的任意一种：
A1）含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；
A2）含有权利要求1所述DNA分子的重组载体，或A1）所述表达盒的重组载体；
A3）含有权利要求1所述DNA分子、A1）所述表达盒或A2）所述重组载体的重组微生物；
A4）含有权利要求1所述DNA分子、A1）所述表达盒或A2）所述重组载体的重组细胞系；
A5）含有权利要求1所述DNA分子、A1）所述表达盒或A2）所述重组载体的转基因植物组织；
A6）含有权利要求1所述DNA分子、A1）所述表达盒或A2）所述重组载体的转基因植物器官。
3.权利要求1所述DNA分子在作为植物诱导型启动子中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述诱导型启动子为逆境诱导型和/或ABA诱导型启动子；所述逆境胁迫为盐胁迫和/或干旱胁迫。
5.权利要求1所述DNA分子或权利要求2的A1）-A3）中任一所述生物材料在植物体内启动目的基因表达的应用及在培育植物品种中的应用。
6.一种权利要求1中SEQIDNo.1所示的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑞芬，陈亚娟，魏建华，王宏芝，
申请(专利权)人：北京农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11