蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白相互作用的方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白相互作用的方法和应用，所述蛋白荧光定位检测系统由四种融合蛋白组成：(1)荧光蛋白A和待测蛋白A组成的融合蛋白；(2)荧光蛋白A、核定位信号和待测蛋白A组成的融合蛋白；(3)荧光蛋白B和待测蛋白B组成的融合蛋白；(4)荧光蛋白B、核定位信号和待测蛋白B组成的融合蛋白；所述荧光蛋白A与荧光蛋白B的荧光颜色不同；所述待测蛋白A和待测蛋白B为待检测是否存在相互作用的两个蛋白。该方法可以在细胞中检测两个蛋白之间是否存在相互作用，还能够消除荧光双分子互补技术和荧光共振能量转移的假阳性问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术和基因工程
，涉及一种通过蛋白荧光定位快速检测蛋白质相互作用的方法。
技术介绍
蛋白相互作用网络是生物信息调控的主要表现形式，是决定细胞生命活动的关键因素。阐释蛋白质之间的相互作用关系，是理解细胞的生物学活性、蛋白的信号转导机制及生物代谢等等生命过程至关重要的一环，能为确定蛋白质在整个生命过程中所办扮演的作用提供决定性的线索。目前蛋白相互作用的研究方法最常用的方法有免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)、酵母双杂交系统(YeastTwo-HybridSystem)、荧光共振能量转移(FluorescentResonantEnergyTransfer,FRET)、双分子荧光互补(BimolecularFluorescentComplement,BIFC)等。但是，不同的方法都存在不同的优缺点，比如免疫共沉淀法操作复杂、不能保证沉淀的复合物为直接相互作用蛋白；酵母双杂交方法只能验证细胞核内的相互作用，并且容易出现假阳性；双分子荧光互补和荧光共振能量转移方法操作相对较为简单、方便，但是存在假阳性较多的问题。因此仍旧需要对研究蛋白相互作用的方法加以改进。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种蛋白荧光定位检测系统及其快速检测蛋白相互作用的方法，该方法能够在细胞水平上快速检测蛋白的相互作用。本专利技术采取的技术方案如下：1、用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，所述蛋白荧光定位检测系统由四种融合蛋白组成：(1)荧光蛋白A和待测蛋白A组成的融合蛋白；(2)荧光蛋白A、核定位信号和待测蛋白A组成的融合蛋白；(3)荧光蛋白B和待测蛋白B组成的融合蛋白；(4)荧光蛋白B、核定位信号和待测蛋白B组成的融合蛋白；所述荧光蛋白A与荧光蛋白B的荧光颜色不同；所述待测蛋白A和待测蛋白B为待检测是否存在相互作用的两个蛋白。优选的，所述荧光蛋白、核定位信号和待测蛋白顺次连接。优选的，所述荧光蛋白A、B为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白。优选的，所述红色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述核定位信号序列如SEQIDNo.3所示。2、上述蛋白荧光定位检测系统中任一种融合蛋白的编码基因。3、含有上述蛋白荧光定位检测系统中任一种融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。优选的，所述重组表达载体为pIZ-V5/His载体，所述重组菌为大肠杆菌DH5α，所述转基因细胞系为家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1。4、上述蛋白荧光定位检测系统在检测蛋白相互作用中的应用。5、上述编码基因在检测蛋白相互作用中的应用。6、上述重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒在检测蛋白相互作用中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术蛋白荧光定位检测系统基本原理示意图如图13所示，本专利技术通过利用具有核定位信号和没有核定位信号的绿色荧光蛋白及红色荧光蛋白构建四个荧光蛋白融合表达载体，若被研究的蛋白之间存在相互作用，则具有荧光标记的融合蛋白就会被另外一个蛋白拉入细胞核内或被拉出细胞核；若被研究的蛋白之间没有相互作用，则被研究的荧光标记的融合蛋白定位不会发生变化。该方法可以在细胞中检测两个都具有核定位信号的蛋白之间的相互作用、一个具有核定位信号的蛋白和一个没有核定位信号蛋白之间的相互作用以及两个都没有核定位信号的蛋白之间的相互作用。另外，该方法消除了先前荧光双分子互补技术和荧光共振能量转移的假阳性问题。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：图1为pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ–EGFP和pIZ–DsRed构建示意图；图2为pIZ-NSL-EGFP、pIZ-NSL-DsRed、pIZ–EGFP和pIZ–DsRed表达载体转染到BmN-SWU1细胞中后荧光蛋白的示意图；标尺为5μm；图3为pIZ-LEF11-DsRed和核定位信号突变的pIZ–LEF11(K100L)-DsRed单独转染细胞后的荧光蛋白定位示意图；标尺为5μm；图4为pIZ–LEF11(K100L)-DsRed和pIZ–EGFP、pIZ-LEF11-EGFP分别共转染后的荧光蛋白定位示意图；标尺为5μm；图5为免疫共沉淀验证对Piz-LEF11(K100L)-DsRed和pIZ-LEF11-EGFP相互作用的进一步验证结果；图6为LEF-11N端截短载体构建示意图；图7为LEF-11N端截短载体的细胞定位示意图；标尺为5μm；图8为LEF-11N端截短载体和pIZ-LEF11-EGFP共同转染后，荧光蛋白定位分析示意图；标尺为5μm；图9为BIFC对LEF-11N端截短载体和pIZ-LEF11-EGFP相互作用的进一步验证示意图；标尺为5μm；图10为本专利技术所述蛋白荧光定位检测系统在研究两个不具有核定位信号的蛋白细胞定位和加上核定位信号的示意图；标尺为10μm；图11为蛋白荧光定位检测系统在一个蛋白加上核定位信号后共定位示意图；标尺为10μm；图12为蛋白荧光定位检测系统鉴定两个不具有核定位信号蛋白的相互作用进一步免疫共沉淀的验证结果；图13为蛋白荧光定位检测系统基本原理示意图。具体实施方式本专利技术以研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中的复制关键因子LEF-11的自身相互作用作为实施例2，鉴定两个同时具有核定位信号蛋白之间相互作用的检测方法；以BmNPVLEF-11自身核定位和多聚化特征为实施例3，鉴定一个具有核定位信号和一个不具有核定位信号的蛋白之间相互作用的检测方法；以家蚕细胞中Gem2基因的相互作用蛋白为实施例4，鉴定两个都没有核定位信号的蛋白之间的相互作用检测的方法。下面将结合附图，对本专利技术3个具有不同核定位方式的蛋白之间的相互作用实例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。需要说明的是，本专利技术所述内容中以NSL表示核定位信号，DsRed表示红色荧光蛋白，EGFP表示绿色荧光蛋白。实施例1、蛋白荧光定位检测载体构建登陆NCBI数据库，下载目前已知的表达DsRed和EGFP蛋白的核苷酸序列，其序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，根据pIZ-V5/His(Invitrogen公司)载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征在于，所述蛋白荧光定位检测系统由四种融合蛋白组成：(1)荧光蛋白A和待测蛋白A组成的融合蛋白；(2)荧光蛋白A、核定位信号和待测蛋白A组成的融合蛋白；(3)荧光蛋白B和待测蛋白B组成的融合蛋白；(4)荧光蛋白B、核定位信号和待测蛋白B组成的融合蛋白；所述荧光蛋白A与荧光蛋白B的荧光颜色不同；所述待测蛋白A和待测蛋白B为待检测是否存在相互作用的两个蛋白。

【技术特征摘要】
1.用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征在于，所述蛋白荧光定
位检测系统由四种融合蛋白组成：(1)荧光蛋白A和待测蛋白A组成的融合蛋白；(2)荧光蛋
白A、核定位信号和待测蛋白A组成的融合蛋白；(3)荧光蛋白B和待测蛋白B组成的融合蛋
白；(4)荧光蛋白B、核定位信号和待测蛋白B组成的融合蛋白；
所述荧光蛋白A与荧光蛋白B的荧光颜色不同；所述待测蛋白A和待测蛋白B为待检测是
否存在相互作用的两个蛋白。
2.根据权利要求1所述的用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征
在于，所述荧光蛋白、核定位信号和待测蛋白顺次连接。
3.根据权利要求1所述的用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征
在于，所述荧光蛋白A、B为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白。
4.根据权利要求3所述的用于检测蛋白间相互作用的蛋白荧光定位检测系统，其特征
在于，所述红色荧光蛋白的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘敏慧，鲁成，董战旗，陈婷婷，胡楠，董非凡，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50