本发明专利技术涉及一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物、分子标记及其检测方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。所述特异性引物是由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，前后引物所包含的两个可变核苷酸位点在大样本群体中的连锁比率达到99.31％，表明该引物对在水稻中具有广泛的适用性。本发明专利技术设计的引物配合筛选出的专用PCR反应体系和反应条件，极大地增加了扩增的准确性和特异性，有效地解决了前人所使用的引物在检测过程中的假阳性问题。利用本发明专利技术设计的特异性引物及其分子标记检测水稻Pita基因的抗/感病类型时，只需要进行一次PCR扩增，此方法具有简单、快捷、经济节约的优点，适合在大样本中快速筛选、分析具抗病基因型的个体和品种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物、分子标记及其检测方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。技术背景稻瘟病是造成水稻严重减产的主要病害之一，每年因稻瘟病导致的生产损失约占总产量的10～15％。目前，发掘广谱稻瘟病抗性基因，通过育种培育广谱持久抗病的水稻品种是控制稻瘟病的主要措施。因此，稻瘟病抗性基因的检测以及稻瘟病抗性水稻种质筛选就显得尤为重要。抗病基因相关的分子标记在遗传育种方面具有重要的意义，分子标记辅助育种(marker-assistedselection,MAS)对于幼苗的筛选和基因型的确定具有简单、快捷、经济节约的优点，适合在大样本中筛选、分析具抗性基因的个体和品种。水稻对稻瘟病的抗性符合基因对基因学说。目前在基因对基因学说中水稻的抗性基因Pita和稻瘟菌的无毒基因AVR-Pita是研究得最为详尽的一对互作关系。AVR-Pita编码223个氨基酸的金属蛋白酶，能与抗性基因Pita产物直接作用。Pita是第一个被克隆的抗性基因。Pita基因编码一个长度为928氨基酸的细胞质膜受体蛋白，该蛋白含核苷酸结合位点结构域(NBS)和富亮氨酸结构域(LRD)。Pita基因抗病/感病两种基因型的编码产物仅有一个氨基酸的差异，即第918氨基酸由抗病型的丙氨酸突变为感病型的丝氨酸，抗病型的Pita基因编码产物的LRD(包含918氨基酸位点)能与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pita编码产物相互作用，引起水稻防卫响应和细胞程序性死亡，从而免受稻瘟病菌侵染。而感病型的Pita基因编码产物则不能与AVR-Pita编码产物相互作用，导致感病(Bryanetal.,2000；Jiaetal.,2000)。Pita918氨基酸的改变是由于Pita基因DNA序列的6640位点(GenBankNo.AF207842)的突变引起的，当该位点核苷酸为G时，所在密码子编码丙氨酸，抗病；当该位点为T时，所在密码子编码丝氨酸，感病(Jiaetal.,2003)。这种由DNA碱基的一个差异所造成抗/感病差异，为使用PCR引物进行带有抗病位点的品种的筛选提供了有利条件，是分子标记辅助育种的经典应用。Jia等人曾根据Pita基因DNA位点的变异以及6640位点与6276位点的连锁，设计了检测6640位点核苷酸变异的特异性引物(YL100/YL102)(Jiaetal.,2002)。但是专利技术人也发现原设计特异性引物识别具有假阳性的现象，也就是说有时候不管6640位点是G还是T，该引物都能扩增出相应的DNA片段，这就导致该分子标记不具有严格的特异性，要进一步确认6640位点的状况还需要通过DNA测序的方式进行确认,显得耗时、耗力、昂贵；此外，Jia等人的引物所基于的两个变异位点(6640和6272)在世界范围内其它地区水稻样本中连锁率很低，导致他们的引物不可用于其它地区水稻的Pita抗性基因型检测。因此，为了更加准确和更加广泛地利用特异性引物检测Pita基因关键抗病位点6640的变异，本专利技术拟通过大规模实验筛选和数据分析，对识别该位点的特异性PCR引物、实验反应体系和实验反应条件进行设计、实验和优选，提供一种快速、准确、特异性强的检测Pita基因抗病基因型的专用引物。参考文献：BryanGT,WuKS,FarrallL,JiaY,HersheyHP,McAdamsSA,FaulkKN,DonaldsonGK,TarchiniR,ValentB.(2000)AsingleaminoaciddifferencedistinguishesresistantandsusceptibleallelesofthericeblastresistancegenePi-ta.PlantCell.12(11):2033-2046.LeeS,CostanzoS,JiaY,OlsenKM,CaicedoAL.(2009)EvolutionarydynamicsofthegenomicregionaroundtheblastresistancegenePi-tainAAgenomeOryzaspecies.Genetics.183(4):1315-1325.JiaY,BryanGT,FarrallL,ValentB.(2003)NaturalVariationatthePi-taRiceBlastResistanceLocus.Phytopathology.93(11):1452-1459.JiaY,McAdamsSA,BryanGT,HersheyHP,ValentB.(2000)DirectInteractionofResistanceGeneandAvirulenceGeneProductsConfersRiceBlastResistance.EmboJournal19,4004-4014.JiaY,WangZ,andSinghP.(2002)DevelopmentofDominantRiceBlastPi-taResistanceGeneMarkers.CropSci42:2145-2149.
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术意在克服现有检测技术中出现假阳性、耗时、昂贵以及不具有广泛适用性等缺陷。其目的是提供一种快速、准确、特异性强的检测Pita基因抗病基因型的特异性专用引物、分子标记和检测方法。为解决上述技术问题和实现本专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物，所述引物由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，所述的引物序列：前引物6640F：5’-GTGGCTTCTATCTTTACCTG-3’后引物7415R：5’-CGAACTCCTTCGCATACTCA-3’一种高效检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的分子标记，所述的分子标记为根据权利要求1所述的特异性引物在Pita基因序列及其3'端调控区扩增出来的核苷酸序列，核苷酸序列长度为814bp。一种利用分子标记检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的方法，包括以下步骤：(1)待测样品水稻植株基因组DNA提取；(2)以步骤(1)中得到的样品DNA为模板，构建专用PCR反应体系，利用权利要求1所述特异性引物进行PCR扩增；(3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，当PCR产物为阳性时，也即能获得条带长度为814bp的PCR产物，该水稻品种对稻瘟病菌(含AVR-Pita)具有抗性；反之，当PCR产物为阴性时，即不能获得条带长度为814bp的PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物，其特征在于：所述引物由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，所述的引物序列：前引物6640F：5’‑GTGGCTTCTATCTTTACCTG‑3’后引物7415R：5’‑CGAACTCCTTCGCATACTCA‑3’
【技术特征摘要】
1.一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物，其特征在于：所述引
物由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，所述的引物序列：
前引物6640F：5’-GTGGCTTCTATCTTTACCTG-3’
后引物7415R：5’-CGAACTCCTTCGCATACTCA-3’
2.一种高效检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的分子标记，其特征在于：所述的分子
标记为根据权利要求1所述的特异性引物在Pita基因序列及其3'端调控区扩增出来的核苷
酸序列，核苷酸序列长度为814bp。
3.一种利用分子标记检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的方法，包括以下步骤：
(1)待测样品水稻植株基因组DNA提取；
(2)以步骤(1)中得到的样品DNA为模板，构建专用PCR反应体系，利用权利要求1所述特
异性引物进行PCR扩增；
(3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，当PCR产物为阳性时，也即能获...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘立娜，李成云，杨静，张寒，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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