一种固定化蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于固定蛋白的方法。本发明专利技术还涉及一种用于固定蛋白的化合物。所述化合物具有氟磺酰基，能够特异性地且共价地在酪氨酸残基处来标记蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于固定蛋白的化合物以及一种用于固定蛋白的方法。
技术介绍
将蛋白固定到如微阵列、芯片和珠等固体载体上是一种用于阐明蛋白-蛋白或蛋白-配体相互作用以及用于以高处理量的方式探测新蛋白功能的强大方法。不同于DNA微阵列的情况，由于在实现将蛋白选择性地且均匀取向地分布到固体表面中的固有困难，实施用于蛋白固定的通用方法存在着挑战。常规固定方法主要依赖三种机理：物理连接、共价键合和生物亲和性固定。然而非选择性的物理连接或共价键合可能阻塞活性部位或甚至使蛋白变性。通过重组融合标签和所偶联蛋白的共表达进行固定可以相应保证蛋白的确切取向并且提供了微调生物结合物拓扑结构的灵活性。例如，将sjGST标签固定到GSH-结合的聚合物珠或将His-标签固定到Ni-NTA芯片或将生物素-标签结合到链霉亲和素涂布的固体载体上已经被广泛地选作非共价蛋白固定方法用于保持所标签蛋白的活性。因此开发一种有效且稳定的固定蛋白的策略，能够最大限度地保持活性，是有着显著意义和应用价值。位置选择性共价固定蛋白最近引起很多关注，因为它能够稳定地、均匀地且高密度地固定各种蛋白。其方法是将所关注的蛋白与标签蛋白共表达，再利用后者与其被固定的底物分子共价地且选择性地反应。比如，Kindermann等报道了一种通过不可逆地将O6-苄基鸟嘌呤衍生物的烷基连接到hAGT半胱氨酸残基之一来固定hAGT-标签的共价方法。GST-标签蛋白具有高底物亲合性，然而，已知的GST标签固定方法仍然基于可逆的GSH-GST结合，限制了它们的应用。Viswanathan等报道了通过铜(I)-催化的Huisgen[3+2]环加成反应(“click”反应)将在C-末端半胱氨酸残基上，用炔改性的GST蛋白共价固定到玻璃表面上的策略。尽管实现了共价和定向结合，但是铜催化剂可引起某些不稳定的蛋白的变性或沉淀，因此有可能在固定后降低了蛋白活性。另外，相比于传统的GSH-GST方法，将炔基团引入GST蛋白是耗时的且高成本的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一类小分子物质，其能够通过位置选择性共价键合的方式共价固定蛋白，特别是sjGST-标签化的蛋白。本专利技术的目的还在于提供一类能够以相对简单的方法合成的具有氟磺酰基的小分子，当用它们处理sjGST-标签化的蛋白时能够共价地、选择性地、不可逆地标记sjGST。具体来说，本专利技术提供了下述技术方案：技术方案1.式I的化合物：其中，R1是苯基的任选取代基；R2是Ar的任选取代基；m是0、1、2、3、4；n是0、1、2、3、4；连接基团是任选被取代的，并且是由下述A组中的0-15个和下述B组中的一个组成的三价基团，A组：─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO2─、─CO─、─C(═NH)─、─C(═S)─、─C(═SO)─、─C(═SO2)─、─C1-10亚烷基─、─C3-10亚环烷基─、与─(3-10)元亚杂环烷基─，B组：─N═、─C1-10次烷基═、─C3-10次环烷基═、与─(3-10)元次杂环烷基═；Ar是苯、萘、单环杂芳基、双环杂芳基；R选自：可与固体表面反应的基团，包括但不限于氨基(NH2)，羟基(OH)，巯基(SH)，羧基(COOH)；荧光团(fluorophore)；生物素部分；-C0-10亚烷基-C≡CH；和氢。技术方案2：根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述式I是下述式II：技术方案3：根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述连接基团选自：技术方案4：根据上述技术方案中任一个的化合物，其中所述-Ar-(R2)n是技术方案5：选自下列的化合物：技术方案6.一种固定蛋白的方法，包括下述步骤：步骤1：通过共价或非共价相互作用，将权利要求1-N中任一项的化合物接枝到固体表面；和步骤2：通过在酪氨酸残基的共价键，将蛋白固定到步骤1中制备的固体表面上；或者步骤1：通过在酪氨酸残基的共价键，使权利要求1-N中任一项的化合物与蛋白反应；和步骤2：通过共价或非共价相互作用，将步骤1中制备的蛋白接枝到固体表面。技术方案7：根据技术方案6的方法，其中所述固体表面包括金属、聚合物或纳米材料的表面。技术方案8：根据技术方案6或7的方法，其中所述共价或非共价相互作用包括生物素-链霉亲和素相互作用或抗原-抗体相互作用。技术方案9：根据技术方案6、7或8的方法，其中所述酪氨酸残基是日本血吸虫谷胱甘肤S-转移酶的酪氨酸-111残基。附图说明图1：通过融合的GST标签蛋白的位置选择性共价固定，其中sjGST，PDBID：1M9A。图2：(A)G1-H和G1-炔的化学结构；(B)重组sjGST蛋白的G1-炔标记(每个条带0.5μg)：荧光扫描(FL，上部)；考马斯蓝着色(CBB，下部)；(C)在(B)中的荧光带的密度测定。图3：添加不同浓度的G1-H的竞争试验：(A)在G1-炔处理前和(B)在G1-炔处理后(sjGST，每个条带0.5μg)。图4：MALDI-TOF-MS显示酪氨酸-111作为G1化合物的结合位点。(A)在胰蛋白酶消化后在G1-H和G1-炔处理的sjGST肽之间检测出52道尔顿的质量偏移。(B)MS/MS分析，在1093和1145处的峰。(C)Y111FsjGST突变体消灭了G1-炔所造成的标记。图5：(A)G1-生物素的化学结构。(B)在G1-生物素预处理的、链霉亲和素-涂布的96-孔微板上的GST-eGFP固定。(C)用渐增量的G1-生物素捕获GST-eGFP的结果(更多GST-eGFP被捕获)。(D)用渐增量的G1-H预培养GST-eGFP逐渐使固定减弱。图6：(A)G1-H固定的琼脂糖凝胶珠的结构。(B)和(C)可溶性(青色，位置靠上)和固定的(绿色，位置靠下)激酶ITK和EGFR的基于HTRF的酶活性实验结果。具体实施方案缩略语：ACN乙腈ATP三磷酸腺苷Beads珠/高分子球Biotin生物素Boc叔丁基氧羰基DCM二氯甲烷DEAD偶氮二甲酸二乙酯DMF二甲基甲酰胺DMSO二甲基亚砜EDTA乙二胺四乙酸eGFP增强绿色荧光蛋白EGFR表皮生长因子受体G1-AlkyneG1-炔G1-biotinG1-生物素GFP绿色荧光蛋白GSH谷胱甘肽GST谷胱甘肤S-转移酶1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓HATU3-氧化物六氟磷酸盐,1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium3-oxidhexafluorophosphateHEP本文档来自技高网...

【技术保护点】
式I的化合物：其中，R1是苯基的任选取代基，选自卤素，NH2‑、CN‑，OH‑，HS‑，‑NO2，‑CF3，‑COOH，CH3CO‑，(C1‑10烷基)‑COO‑，‑O‑C1‑10烷基，C1‑10烷基‑、C2‑10烯基‑、C2‑10炔基‑、单环或双环的C3‑10环烷基‑、芳基‑、芳基‑O‑芳基‑、5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基、(5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基)‑O‑(5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基)‑、(5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基)‑O‑芳基‑、和芳基‑O‑(5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基)‑；R2是Ar的任选取代基，选自卤素，NH2‑、CN‑，OH‑，HS‑，‑NO2，‑CF3，‑COOH，CH3CO‑，(C1‑10烷基)‑COO‑，‑O‑C1‑10烷基，C1‑10烷基‑、C2‑10烯基‑、C2‑10炔基‑、单环或双环的C3‑10环烷基‑、芳基‑、芳基‑O‑芳基‑、5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基、(5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基)‑O‑(5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基)‑、(5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基)‑O‑芳基‑、和芳基‑O‑(5或6元含1‑4个选自O、N和S的杂芳基)‑；m是0、1、2、3、4；n是0、1、2、3、4；连接基团是任选被取代的，并且是由下述A组中的0‑15个和下述B组中的一个组成的三价基团，A组：─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO2─、─CO─、─C(═NH)─、─C(═S)─、─C(═SO)─、─C(═SO2)─、─C1‑10亚烷基─、─C3‑10亚环烷基─、与─(3‑10)元亚杂环烷基─，B组：─N═、─C1‑10次烷基═、─C3‑10次环烷基═、与─(3‑10)元次杂环烷基═；Ar是苯、萘、单环杂芳基、双环杂芳基；R选自：可与固体表面反应的基团；荧光团(fluorophore)；生物素部分；‑C0‑10亚烷基‑C≡CH；和氢。...

【技术特征摘要】
1.式I的化合物：
其中，
R1是苯基的任选取代基，选自卤素，NH2-、CN-，OH-，HS-，-NO2，
-CF3，-COOH，CH3CO-，(C1-10烷基)-COO-，-O-C1-10烷基，C1-10烷基-、
C2-10烯基-、C2-10炔基-、单环或双环的C3-10环烷基-、芳基-、芳基-O-芳基
-、5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基、(5或6元含1-4个选自O、
N和S的杂芳基)-O-(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-、(5或
6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-O-芳基-、和芳基-O-(5或6元含
1-4个选自O、N和S的杂芳基)-；
R2是Ar的任选取代基，选自卤素，NH2-、CN-，OH-，HS-，-NO2，
-CF3，-COOH，CH3CO-，(C1-10烷基)-COO-，-O-C1-10烷基，C1-10烷基-、
C2-10烯基-、C2-10炔基-、单环或双环的C3-10环烷基-、芳基-、芳基-O-芳基
-、5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基、(5或6元含1-4个选自O、
N和S的杂芳基)-O-(5或6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-、(5或
6元含1-4个选自O、N和S的杂芳基)-O-芳基-、和芳基-O-(5或6元含
1-4个选自O、N和S的杂芳基)-；
m是0、1、2、3、4；
n是0、1、2、3、4；
连接基团是任选被取代的，并且是由下述A组中的0-15个和下述B
组中的一个组成的三价基团，
A组：─O─、─NH─、─S─、─SO─、─SO...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘峥婴，郭天林，周怡青，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44