本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8。本发明专利技术的效果在于：利用噬菌体展示技术构建PEDV M蛋白双峰驼源免疫文库，筛选获得8株来自双峰驼IgG重链抗体高变区抗M蛋白VHH抗体基因编码序列，对其进行可溶性表达和ELISA实验证明其均可以同M蛋白相结合，吸光度OD405值的不同表明其同M蛋白结合能力各有差异。8株VHH抗体可通过E.coli的表达，而制备体外重组的基因工程抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及以一种猪流行性腹泻病毒M蛋白单域抗体。
技术介绍
猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。感染PEDV的病猪主要通过粪便传播病毒，发病猪主要表现腹泻、呕吐和脱水等临床特征，是导致哺乳仔猪死亡的主要传染病之一。1971年，PED首次在英国发生，随后扩散到世界各地。我国于1980年首次分离到PEDV，2010年国内大部分养猪地区发生PED疫情，从哺乳仔猪到繁殖母猪均有发病，给养猪户造成了严重地经济损失。PEDV属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，基因组是单股正链具有感染性的RNA,与其他冠状病毒相似,基因组5′端有一个帽子结构(cap),3′端有1个Poly(A)尾,基因组全长为2,8033nt，分别编码S、E、M和N等4个病毒结构蛋白。S担保存在的中和表位能够诱导机体产生中和抗体，对仔猪具有良好的保护效果。PEDV感染早期，机体能够产生抗N和N蛋白的高水平抗体，是研发病毒血清抗体诊断方法的候选抗原。E蛋白在抗病毒研究方面具有应用前景。骆驼属外周血中存在的天然缺失轻链的重链抗体（variabledomainoftheheavychainofHCAbs，VHH）具有其他陆生生物所不具备的生物学特征，它的抗原结合位点仅由重链可变区单一结构域组成，却同普通IgG抗体一样保持着良好和特异的抗原结合能力。VHH是目前可以得到的、具有完整功能的、最小IgG抗体分子片段，分子量为15kDa，是常规IgG的1/10，单克隆抗体的1/3，分子高度4.8nm，直径2.2纳米，也称为纳米抗体（nanobody）。VHH抗体抗原结合位点具有伸展的抗原互补结合区和组织穿透性，可结合普通IgG抗体无法接触的抗原表位。另外，体外重组VHH具有易表达和水溶性好等独特性质，在作为小型化基因工程抗体、小分子抗体药物和高灵敏度诊断试剂研发领域具有广阔应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体；本专利技术的另一个目的是提供一种编码所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的核苷酸序列；本专利技术的再一个目的是提供所述的猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体或其编码序列在E.coli中的表达。本专利技术采用以下技术方案，一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2,SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7或SEQIDNO.8。一种重组表达载体，含有上述的核苷酸序列。一种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有上述的核苷酸序列的原核细胞。优选的，所述宿主细胞为含有上述表达载体的原核细胞。所述猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体或其编码序列在E.coli中的表达。本专利技术的效果在于：利用噬菌体展示技术构建PEDVM蛋白双峰驼源免疫文库，筛选获得8株来自双峰驼IgG重链抗体高变区抗M蛋白VHH抗体基因编码序列，对其进行可溶性表达和ELISA实验证明其均可以同M蛋白相结合，吸光度OD405值的不同表明其同M蛋白结合能力各有差异。8株VHH抗体可通过E.coli的表达，而制备体外重组的基因工程抗体。附图说明图1是是抗PEDVM蛋白VHH克隆氨基酸序列比对结果图；图2是E.coli中抗PEDVM蛋白VHH抗体SDS-PAGE分析图。具体实施方式下面的实施例可以进一步说明本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1、猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体的制备1.材料和方法1.1实验动物和试剂2峰10月龄雌性双峰驼作为实验动物，牛淋巴细胞分离液，96孔酶标板；限制性内切酶，DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒为OMEGA产品，镍亲和层析树脂(Qiagen)；E.coli重组表达PEDVM抗原（His标签和GST标签）；菌株、辅助噬菌体和试剂大肠杆菌TG1和BL21Star(DE3)、辅助噬菌体M13K07、载体pHEN2购于NEB公司，其它试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1骆驼免疫和抗体监测首次免疫，用206佐剂（购于法国seepic公司），乳化500μg重组M蛋白皮下多点（背部，后腿和颈部两侧肌肉）接种骆驼。首免21天后加强免疫，剂量为206乳化1000μgM蛋白，与首免间隔35天、42天和63天加强免疫，抗原接种剂量均为1000μgM蛋白。在首次免疫前和每次加强免疫前均采集静脉血并分离到血清，用M蛋白（GST标签）作为抗原的间接ELISA检测PEDV抗体。本次免疫实验过程中，骆驼饲养管理，免疫，血液样品的采集均在专业兽医工作人员监督指导下完成。1.2.2外周血的分离最后一次免疫后7天（即第63天）颈静脉采抗凝血10mL（抗凝剂为肝素钠，10IU/mL），加入等量的Han`s液做1倍稀释，而后加入等体积淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心分离外周血总淋巴细胞。分离的淋巴细胞用MEM重悬中加入到六孔板中（37℃，5%CO2）静止30min，吸附除去细胞碎片和巨噬细胞，离心收集淋巴细胞加入MEM，保存在液氮中用于细胞RNA提取。1.2.3VHH抗体免疫文库构建设计3对引物（参见表1-VHH基因扩增用引物）通过三轮扩增得到编码VHH蛋白目的基因。通过Trizol试剂抽提淋巴细胞总RNA，用G1作为反转录引物，合成第一链cDNA，以cDNA为模板，H1、G1为引物扩增得到600bp和900bp大小2条DNA带，回收600bp条带作为模板，进行第2轮PCR扩增。以第2轮PCR产物为模板，H2、H3为引物得到450bpDNA带。以2轮PCR产物为模板，P1，TN为上下游引物进行第3轮扩增得到450bp带。将第3轮PCR产物经过SfiI/NotI双酶切克隆到pHEN2载体，电转化方法将连接产物转化到TG1中，37℃，180r/min培养1h，离心浓缩后涂在氨苄抗性的2×YTG平板（2%葡萄糖，100μg/mLAmpr）。同时取10μL稀释至1×104倍涂板，37℃过夜培养，计算库容。转化后平板37℃温箱中培养16小时，用10mL的2×YT培养基将培养板上长出的菌苔刮洗干净，加入终浓度25%的甘油，分装保存在-70℃备用，此为获得的抗PEDVM蛋白VHH免疫抗体库。随机挑选电转化后的克隆进行测序，根据多本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，其特征在于，编码所述抗体的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8。
【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒M蛋白特异性重链抗体，其特征在于，编码所述抗体的核苷酸
序列为：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2,SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQID
NO.6，SEQIDNO.7或SEQIDNO.8。
2.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹双辉，杨顺利，尚佑军，蔡建平，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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