CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA技术

本发明专利技术公开了一种运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA。本发明专利技术的特异性靶向CMAH基因的sgRNA在CMAH基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G；在CMAH基因上的靶序列位于CMAH基因的N端的5个外显子编码区或与相邻内含子的交界处；在CMAH基因上的靶序列是唯一的。本发明专利技术的sgRNA用于CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法中，能够快速、精确、高效、特异性地敲除猪CMAH基因，有效地解决构建CMAH基因敲除猪周期长和成本高的问题。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及基因敲除
，具体涉及CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA。
技术介绍
器官移植是治疗器官衰竭疾病最有效的治疗手段。迄今为止，全球已有近百万的患者通过器官移植而延续生命。随着人口老龄化及医疗技术的进步，需要进行器官移植手术的病人越来越多，但供体器官的短缺严重制约了器官移植手术的开展。以肾脏移植为例，我国每年需要进行肾移植的患者多达30万，而可用于移植的捐献肾脏不超过1万例，大部分患者死于肾衰竭。依靠死后器官捐献已不能满足器官移植的需要。通过基因工程改造其他物种，以提供合适于人体移植的器官，成为解决人类供体器官短缺问题的主要途径。目前，根据生物安全性、生理功能指标、经济性及稀有物种保护等多方面评价，猪成为了最为理想的异种器官来源。但猪和人之间存在巨大的差异，直接将猪的器官移植到人会产生强烈的免疫排斥反应。因此，通过基因工程对猪进行改造，以产生适合于人体移植的器官，成为异种移植的终极目标。免疫学的研究发现猪的细胞表面表达一种糖类化合物：N-羟乙酰神经氨酸(N-GlycolylneuraminicAcid，Neu5Gc)。它的合成依赖于胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidinemonophosphate-N-acetylneuraminicacidhydroxylase，CMAH)。人类细胞由于缺乏有功能的CMAH基因，不能合成Neu5Gc。而猪细胞表面的Neu5Gc进入人体后可被人体免疫系统识别并引发免疫排斥反应。因此，需要消除猪细胞表面的Neu5Gc分子以减少异种供体器官的免疫原性。而准确高效的敲除猪CMAH基因，是消除Neu5Gc引起的免疫排斥的关键步骤。目前，常见的基因敲除技术包括同源重组(HomologusRecombination，HR)技术、类转录激活效应子核酸酶(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease，TALEN)技术、锌指核酸酶(Zinc-FingerNuclease，ZFN)技术以及最近发展的规律成簇间隔短回文重复(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat，CRISPR)技术。HR技术由于重组效率低下(效率大约只有10-6)，对突变体的筛选工作非常耗时和低效，已逐渐被取代。TALEN技术和ZFN技术的切割效率一般能达到20％，但都需要构建可以识别特定序列的蛋白质模块，前期工作繁琐费时。ZFN技术的模块设计较为复杂且有较高的脱靶率，其应用有限。CRISPR是一种源于原核生物的后天免疫系统，该系统执行干扰功能的复合物由蛋白质Cas和CRISPR-RNA(crRNA)组成。目前该系统已发现有三种类型，其中第二类Cas9系统组成简单，已被积极应用于基因工程领域。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA——crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)与靶序列互补识别的原理实现的。现在已经将两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(singleguideRNA)，能够识别特定的基因序列，引导Cas9蛋白进行切割。在真核生物中，DNA被切断后发生非同源重组末端连接，造成移码突变，最终导致基因功能性敲除。相比于上述3种技术，CRISPR技术操作简单、筛选效率高，能够实现精确的靶向切割。因此，通过CRISPR技术敲除CMAH基因能够极大地提高Neu5Gc缺失细胞及基因工程猪的筛选效率。但是该路径的关键技术难题是设计并制备精确靶向的sgRNA，因为基因的靶向精确度高度依赖于sgRNA靶序列，能否成功设计出精确靶向的sgRNA成为敲除目的基因的关键技术问题，本专利技术意在解决该技术问题从而为敲除CMAH基因提供坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供在CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因中用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA，该sgRNA具有以下特点：(1)该sgRNA在CMAH基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合上述规则的靶序列位于正义链或反义链；(2)该sgRNA在CMAH基因上的靶序列位于CMAH基因的N端的5个外显子编码区，或靶序列的一部分位于CMAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子；(3)该sgRNA在CMAH基因上的靶序列是唯一的。作为本专利技术的优选方案，上述靶序列为序列表中SEQIDNO：1～61中任一条序列所示的序列。作为本专利技术的优选方案，上述靶序列为序列表中SEQIDNO：2或4所示的序列。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，该方法包括如下步骤：(1)在第一方面所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上用于形成粘性末端的序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在第一方面所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的两端加上合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的正向寡核苷酸序列与反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸；(2)将上述双链寡聚核苷酸连入线性化的携带Cas9基因的表达载体，得到携带含相应靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆，并对阳性克隆摇菌、提取质粒；(3)用上述携带有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体、包装质粒和包装细胞系包装出同时携带靶向CMAH基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；(4)使用上述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的细胞，以其基因组DNA为模板扩增包含上述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定CMAH基因的敲除情况。作为本专利技术的优选方案，上述表达载体为序列表中SEQIDNO：62所示序列的载体。作为本专利技术的优选方案，上述方法包括如下步骤：(1)在第一方面所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上CACCG序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在第一方面所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的...

【技术保护点】
在运用CRISPR‑Cas9特异性敲除猪CMAH基因中用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA，其特征在于：（1）所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列符合5’‑N(20)NGG‑3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链；（2）所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列位于CMAH基因的N端的5个外显子编码区，或靶序列的一部分位于CMAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子；（3）所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列是唯一的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.22 CN 20151026683221.在运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因中用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA，其特征在于：
（1）所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合所述规则的靶序列位于正义链或反义链；
（2）所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列位于CMAH基因的N端的5个外显子编码区，或靶序列的一部分位于CMAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子；
（3）所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列是唯一的。
2.根据权利要求1所述的用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA，其特征在于，所述靶序列为序列表中SEQIDNO：1~61中任一条序列所示的序列。
3.根据权利要求1所述的用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA，其特征在于，所述靶序列为序列表中SEQIDNO：2或4所示的序列。
4.运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上用于形成粘性末端的序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的两端加上合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的所述正向寡核苷酸序列与反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸；
（2）将所述双链寡聚核苷酸连入线性化的携带Cas9基因的表达载体，得到携带含相应靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆，并对所述阳性克隆摇菌、提取质粒；
（3）用所述携带有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体、包装质粒和包装细胞系包装出同时携带靶向CMAH基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；
（4）使用所述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的细胞，以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定CMAH基因的敲除情况。
5.根据权利要求4所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，其特征在于，所述表达载体为序列表中SEQIDNO：62所示序列的载体。
6.根据权利要求4或5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上CACCG序列，合...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡志明，牟丽莎，谢崇伟，高汉超，刘璐，陈鹏飞，张军方，陆赢，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44