一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法及其应用，该方法包括：1)获得菊花远缘杂交后不同发育时期的正常与败育胚珠；2)采用TCA/丙酮沉淀法分别提取步骤1)中所取得的胚珠样品的蛋白质；3)将步骤2)中的蛋白质预处理后分别用Bradford法进行蛋白质定量，并分别调整蛋白浓度；4)用Caspase活性荧光检测方法对正常与败育胚珠的蛋白进行Caspase活性检测。本发明专利技术针对菊花远缘杂交后胚胎败育的细胞衰老和凋亡现象，提供了一种快速、准确鉴定菊花胚胎败育过程中诱导细胞死亡的关键Caspase酶，为研究菊花胚胎败育的分子机理，挖掘调控胚胎败育的关键基因和蛋白提供了研究基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及菊花杂交育种与蛋白质组学领域，涉及菊花远缘杂交后胚胎在不同发育时期利用荧光分光光度法进行体外检测胚胎败育过程中五种Caspase酶活性的方法，具体地说涉及一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法及其应用。
技术介绍
菊花原产中国，是我国十大名花和世界四大切花之一，产量居首，在花卉生产中占有十分重要的地位。目前，国内菊花品种高达数千个，按栽培方式可以分为盆栽菊、地被菊、切花菊、造型菊四大类。地被菊多用于园林绿化，栽培管理较粗放，因此就需要有更高的适应性和抗性，但多数观赏性状优良的品种对栽培条件要求较高，生物和非生物抗性较差，严重限制了其应用的范围和美化的效果，因此对菊花品种的改良一直是育种工作者研究的重点。目前，运用种间，甚至属间杂交的办法，将菊属及其近缘种属中的优良性状导入栽培菊中是获得菊花新性状，提高菊花抗性的最有效途径之一。然而，已有研究表明，菊花远缘杂交中经常遇到受精前和受精后障碍，导致菊花远缘杂交结实率低，其中受精后障碍更为普遍，即人工杂交后能够完成受精作用过程，但胚胎发育过程中遇到障碍，导致细胞降解、凋亡或死亡，胚胎发育停止，即胚胎败育，最终引起杂交失败。目前对于菊花胚胎败育的研究主要集中在形态结构、组织化学等方面，如胚胎败育发生的时期和胚胎败育的组织结构特征等，很少从细胞衰亡的深层次原因方面开展研究。从形态结构和组织变化方面能明显观察到胚胎细胞从正常到败育是一个细胞凋亡的过程，在这个过程中，细胞器数量减少、结构异常并呈退化状态，细胞质逐渐收缩，细胞壁结构加厚等现象。对菊花的转录组学和蛋白质组学的研究也表明，在菊花败育胚胎中，参与细胞衰老、细胞程序性死亡的基因和蛋白都显著上调和增多，尽管有许多信号可以诱导细胞程序死亡，但它们也有共同的特征，其中凋亡时一系列细胞内蛋白水解酶——Caspase酶的活化就是之一。因此，通过检测菊花胚胎败育过程中Caspase酶的活性，不仅能增加对胚胎败育过程中导致细胞死亡的原因的认识，更利于从基因和蛋白水平挖掘出控制胚胎败育的关键基因和蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法及其应用。探索菊花胚胎发育从正常到败育过程中不同Caspase酶活性的方法，为挖掘控制胚胎败育的关键基因和蛋白提供了基础。本专利技术的目的通过以下技术方案实现的：一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法，包括以下步骤：1)菊花远缘杂交后不同发育时期胚珠的获得选择在人工授粉后会出现胚胎败育现象的杂交组合进行远缘杂交，人工授粉后12天，取形态饱满、发育正常的正常胚珠；人工授粉后18天，部分胚胎开始败育，分别取形态饱满、发育正常的胚珠和不饱满、发育异常的胚珠；一般情况下，取样后立即在液氮中预处理1-2h，然后于-80℃贮存；2)采用TCA/丙酮沉淀法分别提取步骤1)中所取得的3个胚珠样品的蛋白质，得到授粉后12天发育正常的胚珠蛋白质、授粉后18天发育正常和发育异常的胚珠蛋白质；提取的蛋白质于-80℃保存；3)将步骤2)中的蛋白质预处理后分别用Bradford法进行蛋白质定量，并分别用Caspase缓冲液调整蛋白浓度至1μg/μl；4)设空白对照和待测样品，向空白对照孔中加入荧光底物和Caspase缓冲液，向待测样品孔中荧光底物、Caspase缓冲液和蛋白质样品，加样后检测AMC释放量，分析荧光强度，确定蛋白质样品中Caspase的酶活性，采用五种荧光底物分别测定蛋白质样品中对应的五种Caspase的酶活性。使用多功能酶标仪检测AMC释放量。步骤1)中所述的杂交组合中以栽培菊作为母本，野菊作为父本。所述的栽培菊花为‘雨花落英’，所述野菊为菊花脑，该杂交组合在人工授粉后会出现胚胎败育的现象。步骤3)中蛋白质预处理的过程为：向每个蛋白质样品中加Caspase缓冲液并混合均匀，于冰上置放后离心取上清液；优选的，于冰上置放30分钟，离心的条件为：16000g,4℃离心20min。所述的五种荧光底物分别为：Ac-YVAD-AMC、Ac-DEVD-AMC、Ac-LEVD-AMC、Ac-VEID-AMC和Ac-LEHD-AMC。优选的，步骤4)中向空白对照孔加入195μlCaspase缓冲液，5μl荧光底物；向待测样品孔中加入175μlCaspase缓冲液，5μl荧光底物，混匀后再加入20μl步骤3)中所得的蛋白质样品。上述的Caspase缓冲液的配方为：50mM醋酸钠，10mML-半胱氨酸，10％(vol/vol)甘油，0.1％(wt/vol，g/ml，100mlCaspase缓冲液中含0.1gCHAPS)CHAPS，以NaOH或HCl调pH值至6.0。配好后于4℃保存。步骤4)中分析荧光强度时的激发光波长380nm，发射光波长为460nm，检测AMC释放量时的检测温度为27℃。上述的方法在筛选菊花胚胎败育过程中控制胚胎败育的关键Caspase酶中的应用。上述的应用，其在于分析正常胚珠和异常胚珠中各种Capsase酶的活化情况，筛选出活化程度异常的Capsase酶即为控制胚胎败育的关键Caspase酶。步骤2)中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质的过程为：取样品在液氮预冷的研钵中迅速研磨至粉末状，加入提取液制成混合液，将混合液装入离心管中，放在冰上并在摇床上振荡后，在15,000g，4℃下离心15min，取上清液，向上清液中加入洗涤液Ⅰ，充分震荡混匀，-20℃静置0.5-1.5h；然后在15,000g，4℃下离心15min，弃上清，向沉淀中加洗涤液Ⅱ洗涤，-20℃静置30min以上，重复用洗涤液Ⅱ洗涤1-2次后冷冻干燥沉淀，于-80℃保存。上述的提取液为：8M尿素、2％硫脲(g/ml，100ml提取液中含2g硫脲)、1％(v/v)TritionX-100、50mMNaCl、20mMTris，pH＝8.0；所述的洗涤液Ⅰ为：-20℃预冷丙酮加0.07％DTT(g/ml，100ml洗涤液Ⅰ中含0.07gDTT)和10％TCA(g/ml，100ml洗涤液Ⅰ中含10gTCA)；所述的洗涤液Ⅱ为：-20℃预冷丙酮加0.07％DTT(g/ml，100ml洗涤液Ⅱ中含0.07gDTT)。步骤3)中运用Bradford法进行蛋白质定量主要包括以下步骤：配制一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白...

【技术保护点】
一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法，其特征在于包括以下步骤：1)菊花远缘杂交后不同发育时期胚珠的获得选择在人工授粉后会出现胚胎败育现象的杂交组合进行远缘杂交，人工授粉后12天，取形态饱满、发育正常的正常胚珠；人工授粉后18天，部分胚胎开始败育，分别取形态饱满、发育正常的胚珠和不饱满、发育异常的胚珠；2)采用TCA/丙酮沉淀法分别提取步骤1)中所取得的3个胚珠样品的蛋白质，得到授粉后12天发育正常的胚珠蛋白质、授粉后18天发育正常和发育异常的胚珠蛋白质；3)将步骤2)中的蛋白质预处理后分别用Bradford法进行蛋白质定量，并分别用Caspase缓冲液调整蛋白浓度至1μg/μl；4)设空白对照和待测样品，向空白对照孔中加入荧光底物和Caspase缓冲液，向待测样品孔中荧光底物、Caspase缓冲液和蛋白质样品，加样后检测AMC释放量，分析荧光强度，确定蛋白质样品中Caspase的酶活性，采用五种荧光底物分别测定蛋白质样品中对应的五种Caspase的酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种体外检测菊花胚胎败育过程中Caspase活性的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)菊花远缘杂交后不同发育时期胚珠的获得
选择在人工授粉后会出现胚胎败育现象的杂交组合进行远缘杂交，人工授粉后12天，
取形态饱满、发育正常的正常胚珠；人工授粉后18天，部分胚胎开始败育，分别取形态饱
满、发育正常的胚珠和不饱满、发育异常的胚珠；
2)采用TCA/丙酮沉淀法分别提取步骤1)中所取得的3个胚珠样品的蛋白质，得到授
粉后12天发育正常的胚珠蛋白质、授粉后18天发育正常和发育异常的胚珠蛋白质；
3)将步骤2)中的蛋白质预处理后分别用Bradford法进行蛋白质定量，并分别用
Caspase缓冲液调整蛋白浓度至1μg/μl；
4)设空白对照和待测样品，向空白对照孔中加入荧光底物和Caspase缓冲液，向待测
样品孔中荧光底物、Caspase缓冲液和蛋白质样品，加样后检测AMC释放量，分析荧光强
度，确定蛋白质样品中Caspase的酶活性，采用五种荧光底物分别测定蛋白质样品中对应的
五种Caspase的酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述的杂交组合中以栽培菊作为
母本，野菊作为父本。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的栽培菊花为‘雨花落英’，所述野菊
为菊花脑，该杂交组合在人工授粉后会出现胚胎败育的现象。
4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕年军，张凤姣，华笠淳，陈发棣，房伟民，蒋甲福，管志勇，陈素梅，刘兆磊，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32