【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2013年4月4日提交的美国临时申请序列号61/808,594的权益，其教义以引用的方式整体并入本文。政府支持本专利技术是根据由国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的R01-HL118744、R00-HL098364和R01-DK095384在政府支持下完成的。政府对本专利技术拥有某些权利。专利技术背景成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)系统是靶向哺乳动物细胞中的所需基因组位点的一类新型基因组编辑工具。最近公开的II型CRISPR/Cas系统使用Cas9核酸酶，所述Cas9核酸酶通过与杂交至20个核苷酸DNA序列的合成引导RNA复合并且紧接由Cas9识别的NGG基序之前而被靶向基因组位点(因此，(N)20NGG靶DNA序列)。这在所述NGG基序的上游三个核苷酸处产生双链断裂。所述双链断裂引发非同源末端连接，非同源末端连接是易错的且有助于敲除基因等位基因的移码突变；或同源介导修复，其可与外源引入的双链或单链DNA修复模板的使用一起用于敲入或修正基因组中的突变。因此，CRISPR/Cas系统可以是用于治疗性应用的有用工具，但遗憾的是先前公开的报道展示在人干细胞中仅2％-4％的等位基因靶向效率(Mali等,Science339:823-826(2013))。专利技术概述本文所述的研究展示了使用CRISPR/Cas系统的等位基因靶向...
【技术保护点】
一种改变细胞中的靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述多核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和一至两种核糖核酸相接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中所述靶多核苷酸序列被裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约50％至约80％。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.04 US 61/808,5941.一种改变细胞中的靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述多核苷酸序列与成
簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和一至两种核糖核酸相接触，其中所述核
糖核酸将Cas蛋白引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中所述
靶多核苷酸序列被裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约50％至约80％。
2.一种治疗或预防受试者的与多核苷酸序列的表达相关的病症的方法，所述方法包括
(a)通过使所述多核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和一至
两种核糖核酸相接触来离体改变细胞中的靶多核苷酸序列，其中所述核糖核酸将Cas蛋白
引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中所述靶多核苷酸序列被
裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约50％至约80％；以及(b)将所述细胞引
入所述受试者中，从而治疗或预防与所述多核苷酸序列的表达相关的病症。
3.一种同时改变细胞中的多个靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述多核苷酸
序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和多种核糖核酸相接触，其中所
述核糖核酸将Cas蛋白引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中
所述靶多核苷酸序列被裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约50％至约80％。
4.一种治疗或预防受试者的与多核苷酸序列的表达相关的病症的方法，所述方法包括
(a)通过使所述多核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和多种
核糖核酸相接触来离体改变细胞中的靶多核苷酸序列，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导
至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中所述靶多核苷酸序列被裂
解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约50％至约80％；以及(b)将所述细胞引入
所述受试者中，从而治疗或预防与所述多核苷酸序列的表达相关的病症。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白是酿脓链球菌Cas9蛋白或
其功能部分。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述功能部分包含选自由以下组成的组的可操作
连接的Cas9蛋白功能性结构域的组合：DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结
构域以及核酸内切酶结构域。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述功能性结构域形成复合体。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白是来自任何细菌物种的
Cas9蛋白或其功能部分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述功能部分包含选自由以下组成的组的可操作
连接的Cas9蛋白功能性结构域的组合：DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结
构域以及核酸内切酶结构域。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述功能性结构域形成复合体。
11.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白与所述一至两种核糖核
酸复合。
12.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白与所述多种核糖核酸复
合。
13.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶基序是20个核苷酸的DNA序列。
14.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中每个靶基序是20个核苷酸的DNA序列。
15.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶基序是以G开始的20个核苷酸
的DNA序列，并且紧接在由所述Cas蛋白识别的NGG基序之前。
16.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中每个靶基序是以G开始的20个核苷酸
的DNA序列，并且紧接在由所述Cas蛋白识别的NGG基序之前。
17.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶基序是20个核苷酸的DNA序列，
并且紧接在由所述Cas蛋白识别的NGG基序之前。
18.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中每个靶基序是20个核苷酸的DNA序列，
并且紧接在由所述Cas蛋白识别的NGG基序之前。
19.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶基序是G(N)19NGG。
20.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中每个靶基序是G(N)19NGG。
21.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶基序是(N)20NGG。
22.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中每个靶基序是(N)20NGG。
23.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列被裂解以使得产
生双链断裂。
24.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中每个靶多核苷酸序列被裂解以使得产
生双链断裂。
25.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列被裂解以使得产
生单链断裂。
26.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中每个靶多核苷酸序列被裂解以使得产
生单链断裂。
27.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述改变是插入缺失。
28.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述改变导致所述靶多核苷酸序列的
表达降低。
29.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述改变导致所述靶多核苷酸序列的
表达降低。
30.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述改变导致所述靶多核苷酸序列的
敲除。
31.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述改变导致所述靶多核苷酸序列的
敲除。
32.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述改变使得所述靶多核苷酸序列从
不想要的序列修正为所需序列。
33.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述改变使得所述靶多核苷酸序列从
不想要的序列修正为所需序列。
34.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述改变是纯合改变。
35.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中每个改变是纯合改变。
36.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中在所述靶多核苷酸序列的裂解之后，
发生同源介导修复。
37.根据权利要求36所述的方法，其中使用外源引入的DNA修复模板进行同源介导修
复。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述外源引入的DNA修复模板是单链的。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述外源引入的DNA修复模板是双链的。
40.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中在所述靶多核苷酸序列的裂解之后，
发生同源介导修复。
41.根据权利要求40所述的方法，其中使用外源引入的DNA修复模板进行同源介导修
复。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述外源引入的DNA修复模板是单链的。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述外源引入的DNA修复模板是双链的。
44.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是外周血细胞。
45.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞或多能细胞。
46.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞。
47.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34+细胞。
48.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34+流动的外周血细胞。
49.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34+脐带血细胞。
50.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34+骨髓细胞。
51.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34+CD38-谱系-CD90+CD45RA-细胞。
52.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
53.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列是CCR5。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸中的至少一种包含选自
由图1的核糖核酸序列组成的组的序列。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸中的至少一种包含与选
自由图1的所述核糖核酸序列组成的组的序列具有单个核苷酸错配的序列。
56.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列是CXCR4。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸中的至少一种包含选自
由图2的核糖核酸序列组成的组的序列。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸中的至少一种包含与选
自由图2的所述核糖核酸序列组成的组的序列具有单个核苷酸错配的序列。
59.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含CCR5的多个
不同部分。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述多种核糖核酸中的每种包含选自由图1的所
述核糖核酸序列组成的组的不同序列。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述多种核糖核酸中的每种包含与选自由图1的
所述核糖核酸序列组成的组的不同序列具有单个核苷酸错配的序列。
62.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含CXCR4的多
个不同部分。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述多种核糖核酸中的每种包含选自由图2的所
述核糖核酸序列组成的组的不同序列。
64.根据权利要求59所述的方法，其中所述多种核糖核酸中的每种包含与选自由图2的
所述核糖核酸序列组成的组的不同序列具有单个核苷酸错配的序列。
65.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含CCR5的至少
一部分和CXCR4的至少一部分。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述多种核糖核酸中的每种包含选自由图1的所
述核糖核酸序列和图2的所述核糖核酸序列组成的组的不同序列。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述多种核糖核酸中的每种包含与选自由图1的
所述核糖核酸序列和图2的所述核糖核酸序列组成的组的不同序列具有单个核苷酸错配的
序列。
68.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述病症是遗传性病症。
69.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述病症是单基因病症。
70.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述病症是人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
71.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述病症是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
72.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸被设计成与紧
邻由所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。
73.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸中的每种被设
计成与紧邻由所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交，所述靶基序位于定位
在所述靶基序之间的突变等位基因侧翼。
74.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述多种核糖核酸被设计成与紧邻由
所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。
75.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述多种核糖核酸被设计成与紧邻由
所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交，所述靶基序位于定位在所述靶基序
之间的突变等位基因侧翼。
76.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中选择所述一至两种核糖核酸以使与除
所述靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交最小化。
77.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中选择所述多种核糖核酸以使与除所述
靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交最小化。
78.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中选择所述靶基序以使得当与所述细胞
中的所有其他基因组核苷酸序列相比较时所述靶基序含有至少两个错配。
79.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中选择每个靶基序以使得当与所述细胞
中的所有其他基因组核苷酸序列相比较时所述靶基序含有至少两个错配。
80.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中选择所述靶基序以使得当与所述细胞
中的所有其他基因组核苷酸序列相比较时所述靶基序含有至少一个错配。
81.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中选择所述靶基序以使得当与所述细胞
中的所有其他基因组核苷酸序列相比较时所述靶基序含有至少一个错配。
82.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸与靶基序杂
交，所述靶基序当与所述细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比较时含有至少两个错
配。
83.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述多种核糖核酸中的每种与靶基序
杂交，所述靶基序当与所述细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比较时含有至少两个错
配。
84.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸与靶基序杂
交，所述靶基序当与所述细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比较时含有至少一个错
配。
85.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述多种核糖核酸中的每种与靶基序
杂交，所述靶基序当与所述细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比较时含有至少一个错
配。
86.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中在每个基因座处所述改变效率是约
50％至约80％。
87.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白由修饰的核酸编码。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述修饰的核酸包含核糖核酸，所述核糖核酸含
有至少一个选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：假尿苷、5-甲基胞苷、2-硫代-尿苷、5-甲
基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸以及5-氮杂尿苷-
5’-三磷酸。
89.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸中的至少一种是修饰的
核糖核酸，所述修饰的核糖核酸包含一至两个选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：假尿
苷、5-甲基胞苷、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢
尿苷-5’-三磷酸以及5-氮杂尿苷-5’-三磷酸。
90.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中从质粒表达所述Cas蛋白或所述核糖
核酸中的任一种。
91.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中使用经优化以用于在干细胞中增加表
达的启动子表达所述Cas蛋白或所述核糖核酸中的任一种。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：巨细胞病毒
(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α启动子
以及泛素启动子。
93.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其还包括选择表达所述Cas蛋白的细胞。
94.根据权利要求93所述的方法，其中选择细胞包括FACS。
95.根据权利要求94所述的方法，其中FACs用于选择共表达Cas和荧光蛋白的细胞，所
述荧光蛋白选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的组。
96.一种改变细胞中的靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括使选自由人多能细胞、原
代人细胞和非转化的人细胞组成的组的细胞中的所述多核苷酸序列与成簇规律间隔的短
回文重复序列相关(Cas)蛋白质和一至两种核糖核酸相接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白
引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中所述靶多核苷酸序列被
裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约8％至约80％。
97.一种治疗或预防受试者的与多核苷酸序列的表达相关的病症的方法，所述方法包
括(a)通过使选自由人多能细胞、原代人细胞和非转化的人细胞组成的组的细胞中的所述
多核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和一至两种核糖核酸相
接触来离体改变细胞中的靶多核苷酸序列，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导至所述靶多
核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中所述靶多核苷酸序列被裂解，并且其中
所述改变效率是约8％至约80％；以及(b)将所述细胞引入所述受试者中，从而治疗或预防
与所述多核苷酸序列的表达相关的病症。
98.一种同时改变细胞中的多个靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括使选自由人多
能细胞、原代人细胞和非转化的人细胞组成的组的细胞中的所述多核苷酸序列与成簇规律
间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和多种核糖核酸相接触，其中所述核糖核酸将Cas
蛋白引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中所述靶多核苷酸序
列被裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约8％至约80％。
99.一种治疗或预防受试者的与多核苷酸序列的表达相关的病症的方法，所述方法包
括(a)通过使选自由人多能细胞、原代人细胞和非转化的人细胞组成的组的细胞中的所述
多核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和多种核糖核酸相接触
来离体改变细胞中的靶多核苷酸序列，其中所述核糖核酸将Cas蛋白引导至所述靶多核苷
酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交，其中所述靶多核苷酸序列被裂解，并且其中表达
Cas蛋白的细胞的改变效率是约8％至约80％；以及(b)将所述细胞引入所述受试者中，从而
治疗或预防与所述多核苷酸序列的表达相关的病症。
100.一种包含至少一种核糖核酸的组合物，所述至少一种核糖核酸具有选自由图1的
核糖核酸序列组成的组的序列。
101.一种包含至少一种核糖核酸的组合物，所述至少一种核糖核酸包含与选自由图1
的核糖核酸序列组成的组的序列具有单个核苷酸错配的序列。
102.一种包含至少一种核糖核酸的组合物，所述至少一种核糖核酸具有选自由图2的
核糖核酸序列组成的组的序列。
103.一种包含至少一种核糖核酸的组合物，所述至少一种核糖核酸包含与选自由图2
的核糖核酸序列组成的组的序列具有单个核苷酸错配的序列。
104.一种包含至少一种核糖核酸的组合物，所述至少一种核糖核酸具有选自由以下组
成的组的序列：图1的核糖核酸序列、图2的核糖核酸序列、与图1的核糖核酸序列具有单个
核苷酸错配的序列以及与图2的核糖核酸序列具有单个核苷酸错配的序列。
105.根据权利要求100-104中任一项所述的组合物，其中所述核糖核酸中的至少一种
是修饰的核糖核酸，所述修饰的核糖核酸包含一至两个选自由以下组成的组的修饰的核苷
酸：假尿苷、5-甲基胞苷、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,
6-二氢尿苷-5’-三磷酸以及5-氮杂尿苷-5’-三磷酸。
106.根据权利要求100-104中任一项所述的组合物，其还包含编码Cas蛋白的核酸序
列。
107.根据权利要求100-104中任一项所述的组合物，其还包含编码Cas9蛋白或其功能
部分的核酸序列。
108.根据权利要求107所述的组合物，其中所述核酸包含修饰的核糖核酸，所述修饰的
核糖核酸包含至少一个选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：假尿苷、5-甲基胞苷、2-硫
代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸以及
5-氮杂尿苷-5’-三磷酸。
109.一种包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含编码Cas蛋白的核糖核酸和至少
一种另外核糖核酸，所述至少一种另外核糖核酸具有选自由图1的核糖核酸序列组成的组
的序列。
110.一种包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含编码Cas蛋白的核糖核酸和至少
一种另外核糖核酸，所述至少一种另外核糖核酸具有选自由图2的核糖核酸序列组成的组
的序列。
111.一种包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含编码Cas蛋白的核糖核酸和至少
一个另外核糖核酸序列，所述至少一个另外核糖核酸序列包含与选自由图1的核糖核酸序
列组成的组的序列具有单个核苷酸错配的序列。
112.一种包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含编码Cas蛋白的核糖核酸和至少
一个另外核糖核酸序列，所述至少一个另外核糖核酸序列包含与选自由图2的核糖核酸序
列组成的组的序列具有单个核苷酸错配的序列。
113.一种包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含编码Cas蛋白的核糖核酸和至少
一种另外核糖核酸，所述至少一种另外核糖核酸具有选自由以下组成的组的序列：图1的核
糖核酸序列、图2的核糖核酸序列、与图1的核糖核酸序列具有单个核苷酸错配的序列以及
与图2的核糖核酸序列具有单个核苷酸错配的序列。
114.根据权利要求109-113中任一项所述的组合物，其还包含编码荧光蛋白的核酸序
列，所述荧光蛋白选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的组。
115.根据权利要求109-113中任一项所述的组合物，其还包含可操作地连接至所述嵌
合核酸的启动子。
116.根据权利要求115所述的组合物，其中所述启动子被优化以用于在人干细胞中增
加表达。
117.根据权利要求116所述的组合物，其中所述启动子选自由以下组成的组：巨细胞病
毒(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α启动
子以及泛素启动子。
118.根据权利要求109-113中任一项所述的组合物，其中所述嵌合核酸包含至少一个
选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：假尿苷、5-甲基胞苷、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-
三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸以及5-氮杂尿苷-5’-三磷酸。
119.根据权利要求109-113中任一项所述的组合物，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白或
其功能部分。
120.一种改变细胞中的靶多核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒包括Cas9蛋白或编码所
述Cas9蛋白的核酸，以及选自由以下组成的组的至少一个核糖核酸序列：图1的核糖核酸序
列、图2的核糖核酸序列、与图1的核糖核酸序列具有单个核苷酸错配的序列以及与图2的核
糖核酸序列具有单个核苷酸错配的序列。
121.根据权利要求120所述的试剂盒，其还包括选自由以下组成的组的一种或多种细
胞系、培养物或群体：人多能细胞、原代人细胞和非转化的细胞。
122.根据权利要求120所述的试剂盒，其还包括DNA修复模板。
123.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞包含原代细胞。
124.根据权利要求1-4和123中任一项所述的方法，其中所述细胞包含原代体细胞。
125.根据权利要求1-4和123或124中任一项所述的方法，其中所述细胞包含自体原代
体细胞。
126.根据权利要求1-4和123-125中任一项所述的方法，其中所述细胞包含同种异体原
代体细胞。
127.根据权利要求1-2和123-126中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列是
B2M。
128.根据权利要求1-2和123-127中任一项所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸中
的至少一种包含经优化以靶向所述B2M基因的序列。
129.根据权利要求1-2和123-128中任一项所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸中
的至少一种包含与经优化以靶向所述B2M基因的序列具有单个核苷酸错配的序列。
130.根据权利要求3-4和123-126中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含
B2M的多个不同部分。
131.根据权利要求3-4、123-126和130中任一项所述的方法，其中所述多种核糖核酸中
的每种包含经优化以靶向所述B2M基因的不同序列。
132.根据权利要求3-4、123-126和130-131中任一项所述的方法，其中所述多种核糖核
酸中的每种包含与经优化以靶向所述B2M基因的不同序列具有单个核苷酸错配的序列。
133.根据权利要求1-132中任一项所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸包含两个
引导核糖核酸序列。
134.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述一至两种核糖核酸包含两个引
导核糖核酸序列。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含CCR5。
136.根据权利要求134或135所述的方法，其中所述细胞包含原代CD34+造血祖细胞。
137.根据权利要求134-136中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与选自由SEQIDNO:1-139组成的组的不同序列互补的两个引导核糖核酸序列的任何组
合。
138.根据权利要求134-136中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与选自由SEQIDNO:1-139组成的组的偏移序列互补的两个引导核糖核酸序列的任何组
合。
139.根据权利要求134-137中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与选自由SEQIDNO:1-139组成的组的CCR5中的偏移靶位点杂交且使Cas蛋白靶向所述
偏移靶位点的两个引导核糖核酸序列的任何组合。
140.根据权利要求134-139所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包含来自SEQ
IDNO:298-303的两个引导核糖核酸序列的任何组合。
141.根据权利要求134-140中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含选自由以下组成的组的一对引导核糖核酸：SEQIDNO:299和303、SEQIDNO:298和300、
SEQIDNO:299和300、SEQIDNO:298和303、SEQIDNO:299和301、SEQIDNO:298和299、
SEQIDNO:301和303、SEQIDNO:298和302、以及SEQIDNO:298和301。
142.根据权利要求134-141所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包含与选自
由SEQIDNO:304-333组成的组的不同序列互补的两个引导核糖核酸序列的任何组合。
143.根据权利要求134-142中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与选自由SEQIDNO:304-333组成的组的偏移序列互补的两个引导核糖核酸序列的任何
组合。
144.根据权利要求134-143中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与选自由SEQIDNO:304-333组成的组的CCR5中的偏移靶位点杂交且使Cas蛋白靶向所
述偏移靶位点的两个引导核糖核酸序列的任何组合。
145.根据权利要求134所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含CXCR4。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述细胞包含原代CD34+造血祖细胞。
147.根据权利要求145或146所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包含与选自
由SEQIDNO:140-297组成的组的不同序列互补的两个引导核糖核酸序列的任何组合。
148.根据权利要求145-147中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与选自由SEQIDNO:140-297组成的组的偏移序列互补的两个引导核糖核酸序列的任何
组合。
149.根据权利要求145-148中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与选自由SEQIDNO:140-297组成的组的CXCR4中的偏移靶位点杂交且使Cas蛋白靶向所
述偏移靶位点的两个引导核糖核酸序列的任何组合。
150.根据权利要求134所述的方法，其中所述靶多核苷酸序列包含B2M。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述细胞包含原代细胞。
152.根据权利要求150或151所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包含与所述
B2M基因中的不同序列互补的两个引导核糖核酸序列的任何组合。
153.根据权利要求150-152中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与所述B2M基因中的偏移序列互补的两个引导核糖核酸序列的任何组合。
154.根据权利要求150-153中任一项所述的方法，其中所述两个引导核糖核酸序列包
含与B2M中的偏移靶位点杂交且使Cas蛋白靶向所述偏移靶位点的两个引导核糖核酸序列
的任何组合。
155.一种改变原代细胞中的靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述多核苷酸序
列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和至少两种核糖核酸相接触，其中
所述至少两种核糖核酸包含将Cas蛋白引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶
基序杂交的引导核糖核酸，其中所述靶多核苷酸序列被裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞
的改变效率是约50％至约80％。
156.一种治疗或预防受试者的与多核苷酸序列的表达相关的病症的方法，所述方法包
括(a)通过使所述多核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和至
少两种核糖核酸相接触来离体改变原代细胞中的靶多核苷酸序列，其中所述至少两种核糖
核酸包含将Cas蛋白引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交的引导核
糖核酸，其中所述靶多核苷酸序列被裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约
50％至约80％；以及(b)将所述细胞引入所述受试者中，从而治疗或预防与所述多核苷酸序
列的表达相关的病症。
157.一种同时改变原代细胞中的多个靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述多
核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和多种核糖核酸相接触，
其中所述核糖核酸包含将Cas蛋白引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序
杂交的引导核糖核酸，其中所述靶多核苷酸序列被裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改
变效率是约50％至约80％。
158.一种治疗或预防受试者的与多核苷酸序列的表达相关的病症的方法，所述方法包
括(a)通过使所述多核苷酸序列与成簇规律间隔的短回文重复序列相关(Cas)蛋白质和多
种核糖核酸相接触来离体改变原代细胞中的靶多核苷酸序列，其中所述核糖核酸包含将
Cas蛋白引导至所述靶多核苷酸序列的靶基序并且与所述靶基序杂交的引导核糖核酸，其
中所述靶多核苷酸序列被裂解，并且其中表达Cas蛋白的细胞的改变效率是约50％至约
80％；以及(b)将所述细胞引入所述受试者中，从而治疗或预防与所述多核苷酸序列的表达
相关的病症。
159.根据权利要求155-158中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白是酿脓链球菌Cas9
蛋白或其功能部分。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述功能部分包含选自由以下组成的组的可
操作连接的Cas9蛋白功能性结构域的组合：DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋
酶结构域以及核酸内切酶结构域。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述功能性结构域形成复合体。
162.根据权利要求155-158中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白是来自任何细菌物
种的Cas9蛋白或其功能部分。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述功能部分包含选自由以下组成的组的可
操作连接的Cas9蛋白功能性结构域的组合：DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋
酶结构域以及核酸内切酶结构域。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述功能性结构域形成复合体。
165.根据权利要求155-156中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白与所述一至两种核
糖核酸复合。
166.根据权利要求155-158中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白与所述多种核糖核
酸复合。
167.根据权利要求155-156中任一项所述的方法，其中所述靶基序是20个核苷酸的DNA
序列。
168.根据权利要求157-158中任一项所述的方法，其中每个靶基序是20个核苷酸的DNA
序列。
169.根据权利要求155-156中任一项所述的方法，其中所述靶基序是以G开始的20个核
苷酸的DNA序列，并且紧接在由所述Cas蛋白识别的NGG...
【专利技术属性】
技术研发人员：克兰·穆苏奴卢，沙达·A·考恩，德里克·J·罗西，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，儿童医学中心公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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