一种鸡干扰素冻干剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，属于动物疫苗领域。本发明专利技术的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，包括无菌采集健康鸡鲜血，于10℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH4Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去 NH4Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％鸡血清的Eagle`s MEM混合培养液悬浮，将鸡白细胞数稀释在10×107个/ml～25×107个/ml之间，制得鸡白细胞悬浮液等六个步骤。本发明专利技术的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法具有制备长效的鸡病毒干扰素制剂，10天注射一次，对鸡病毒性疾病具有良好效果的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种冻干剂的制备方法，特别是一种鸡干扰素冻干剂的制备方法。
技术介绍
鸡干扰素是研究最早的动物干扰素之一，20世纪80年代就有鸡干扰素的相关报道。已发现的鸡干扰素包括INF-α、β、ω、δ和INF-γ，现在已完成基因克隆、测序和定位。近年来，对鸡干扰素的诱导条件和理化活性有了进一步的研究，同时对鸡白细胞干扰素进行了大量的临床试验。研究表明，它对鸡的许多病毒性传染病如流行性腹泻、鸡瘟、传染性胃肠炎等，以及对牛病毒性腹泻、小鹅瘟、羔羊腹泻等都具有显著疗效，试验证实鸡干扰素与牛羊等动物之间存在交叉活性。目前尚未有一种高效的用于治疗鸡病毒病的干扰素制剂。现有的鸡干扰素必须每天重复用药，价格昂贵，治疗效果欠佳。今后的发展趋势是寻找一种高效价格低廉的长效干扰素制剂，能够用于临床，对人而言，主要用作免疫增强剂和无毒副作用，动物主要用于病毒病的治疗。目前尚未有鸡的长效干扰素投放市场。我们拟通过基因修饰建立鸡长效干扰素，研制一种有效的制剂，3-5年投放市场。干扰素（IFN）是一类具有广泛生物学活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分，鸡干扰素是治疗鸡病毒性疾病的首选药物。鸡是现代农业发展的主要项目，发展养鸡生产是关系国计民生的大问题。困扰养鸡业发展的主要问题是疾病问题，而鸡的传染性疾病是对鸡的最大危害，我国每年因鸡的传染性疾病造成的经济损失达数十亿元，严重阻碍养鸡业的发展。在鸡的传染病中病毒性疾病占主导地位，约占85％。对于鸡的病毒性传染病（如鸡瘟、口蹄疫、鸡繁殖与呼吸综合征等）目前主要靠疫苗进行预防。鸡病毒性疾病绝大多数都有可用的疫苗进行预防。近年来，随着鸡病毒新毒株、变异株的不断出现，我国鸡病毒病的防治面临严峻的挑战，目前的预防和治疗措施已经不能有效地控制疫病的发展，其危害日益严重，因此迫切需要一种有效的防治措施和高效的药物。对动物的病毒性传染病的治疗只有依靠高免血清或病毒干扰制剂。由于受价格和动物适应性的影响，目前尚无可供的高免血清用于鸡病毒性疾病的治疗。虽然已经研究出可以用于治疗病毒性疾病的干扰素制剂，如聚肌胞、鸡干扰素等，但这些产品存在严重缺陷，这类药品半衰期短、疗效差、价格高。对患病动物每天必须重复用药，增加了用药的成本，往往达不到预期效果，使这类药物的应用受到严重的制约。到目前为止，还没有一种有效而实用的药物用于鸡病毒性疾病的治疗，所以研制高效的抗病毒药物是治疗鸡病毒性疾病的重要手段，是防治鸡病毒性传染病发展养鸡生产所必须。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供一种制备长效的鸡病毒干扰素制剂，10天注射一次，对鸡病毒性疾病具有良好效果的鸡干扰素冻干剂的制备方法。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，包括以下步骤，步骤一：无菌采集健康鸡鲜血，于10℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH4Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去NH4Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％鸡血清的Eagle`sMEM混合培养液悬浮，将鸡白细胞数稀释在10×107个/ml～25×107个/ml之间，制得鸡白细胞悬浮液；步骤二：取一份鸡白细胞悬浮液，加入含100个活性单位的鸡白细胞干扰素，置于37℃水浴摇床搅拌培养36h；步骤三：按照每毫升鸡白细胞悬液50HANDVⅡ的加入量，在细胞悬液中加入一定量新城疫病毒NDVⅡ，调节pH为7.2，在水浴恒温振荡器37℃旋转培养24h，培养完成后，用6MHCl把培养液的pH调至3.5，在4℃下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的NaOH溶液把pH调至7.2，离心去除沉淀，取上清液，制得鸡白细胞干扰素粗制液；步骤四：取一份鸡白细胞干扰素粗制液，用NaOH溶液调节pH值到8.5，在冰浴条件下，按照干扰素粗制液：聚乙二醇酯摩尔比1:5向溶液中加入聚乙二醇酯，聚乙二醇酯加入量为五份，升温至4℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至12℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至25℃，搅拌反应2h，向溶液加入五份聚乙二醇酯，升温至36℃，搅拌反应2h，完全反应后，加入0.75Μ的半胱甘氨酸终止反应，得到聚乙二醇酯修饰的干扰素；由于采用了上述技术方案，采用聚乙二醇酯对干扰素进行修饰，能够扩大干扰素分子的分子大小，使得干扰素不易经过肾脏代谢而排出体外，从而延长了干扰素在鸡体内的存在时间；同时能够提高干扰素的稳定性，延长半衰期，降低免疫原性，提高干扰素的水溶性。步骤五：取一份聚乙二醇酯修饰的干扰素，取适量去离子水作为溶剂，按照聚乙二醇酯修饰的干扰素：烷基丁二酸酯磺酸钠摩尔比1:1向溶液中加入烷基丁二酸酯磺酸钠，用盐酸调节pH为2.6，按照烷基丁二酸酯磺酸钠：α-氰基丙烯酸丁酯摩尔比1:2.5向溶液中加入α-氰基丙烯酸丁酯，搅拌10min，再用NaOH调节溶液的pH为5.8，继续搅拌反应，用0.8μm微孔滤膜除去大的纳米球，得纳米球乳状胶体溶液；由于采用了上述技术方案，将干扰素以α-氰基丙烯酸丁酯为载体，制备成为纳米球粒径，能够成团靶向给药；同时有具有良好的分散性，在到达靶点后能够分散作用，提高干扰素的药效作用力。步骤六：取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，按照纳米球乳状胶体：渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条件下加入渗透性保护液，继续在次声波条件下振荡30~45s，将溶液置于真空度0.98的环境下，设置温度为-12℃，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻3h后，将溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置温度为-20℃，按照120Pa/min的速度恢复气压至常压，得到鸡干扰素冻干剂。由于采用了上述技术方案，温度在3.9℃的条件下DMSO对细胞毒性最小，但是温度过低，冻存液中可能形成小冰晶，从而对细胞造成机械损伤，因此将温度控制在3.2~3.9℃。在次声波振荡条件下，可以将冷冻保护剂迅速扩散开，渗透入乳状胶体的内部，将干扰素分子完全置于在冷冻保护剂中。在真空状态下，经过预冻存后投入液氮中，阻隔空气热交换，提高冷冻效率，能够迅速降温，提高冻存脱水的效率，从而避免在冷冻过程中出现小冰晶，使得干扰素直接形成玻璃体，提高了冻存的存活率，实现活性无损冻干。本专利技术的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，所述渗透性保护液由3%~3.8%的DMSO，4.8%~5.6%的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，步骤一：无菌采集健康鸡鲜血，于10℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH4Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去 NH4Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％鸡血清的Eagle`s MEM混合培养液悬浮，将鸡白细胞数稀释在10×107个/ml～25×107个/ml之间，制得鸡白细胞悬浮液；步骤二：取一份鸡白细胞悬浮液，加入含100个活性单位的鸡白细胞干扰素，置于37℃水浴摇床搅拌培养36h；步骤三：按照每毫升鸡白细胞悬液50HA NDVⅡ的加入量，在细胞悬液中加入一定量新城疫病毒NDVⅡ，调节pH为7.2，在水浴恒温振荡器37℃旋转培养24h，培养完成后，用6M HCl把培养液的pH调至3.5，在4℃下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的 NaOH溶液把pH调至7.2，离心去除沉淀，取上清液，制得鸡白细胞干扰素粗制液；步骤四：取一份鸡白细胞干扰素粗制液，用NaOH溶液调节pH值到8.5，在冰浴条件下，按照干扰素粗制液：聚乙二醇酯摩尔比1:5向溶液中加入聚乙二醇酯，聚乙二醇酯加入量为五份，升温至4℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至12℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至25℃，搅拌反应2h，向溶液加入五份聚乙二醇酯，升温至36℃，搅拌反应2h，完全反应后，加入0.75Μ的半胱甘氨酸终止反应，得到聚乙二醇酯修饰的干扰素；步骤五：取一份聚乙二醇酯修饰的干扰素，取适量去离子水作为溶剂，按照聚乙二醇酯修饰的干扰素：烷基丁二酸酯磺酸钠摩尔比1:1向溶液中加入烷基丁二酸酯磺酸钠，用盐酸调节pH为2.6，按照烷基丁二酸酯磺酸钠：α‑氰基丙烯酸丁酯摩尔比1:2.5向溶液中加入α‑氰基丙烯酸丁酯，搅拌10min，再用NaOH调节溶液的pH为5.8，继续搅拌反应，用0.8μm微孔滤膜除去大的纳米球，得纳米球乳状胶体溶液；步骤六：取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，按照纳米球乳状胶体：渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条件下加入渗透性保护液，继续在次声波条件下振荡30~45s，将溶液置于真空度0.98的环境下，设置温度为‑12℃，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻3h后，将溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置温度为‑20℃，按照120Pa/min的速度恢复气压至常压，得到鸡干扰素冻干剂。...

【技术特征摘要】
1.一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤一：无菌采集健康鸡鲜血，于10℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量
分数为0.85％NH4Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去NH4Cl，按照白细胞：培养液体
积比1:15加入含5％鸡血清的Eagle`sMEM混合培养液悬浮，将鸡白细胞数稀释在10×107个/ml～25×107个/ml之间，制得鸡白细胞悬浮液；
步骤二：取一份鸡白细胞悬浮液，加入含100个活性单位的鸡白细胞干扰素，置于37℃
水浴摇床搅拌培养36h；
步骤三：按照每毫升鸡白细胞悬液50HANDVⅡ的加入量，在细胞悬液中加入一定量新
城疫病毒NDVⅡ，调节pH为7.2，在水浴恒温振荡器37℃旋转培养24h，培养完成后，用6MHCl
把培养液的pH调至3.5，在4℃下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的NaOH溶液把pH调至
7.2，离心去除沉淀，取上清液，制得鸡白细胞干扰素粗制液；
步骤四：取一份鸡白细胞干扰素粗制液，用NaOH溶液调节pH值到8.5，在冰浴条件下，按
照干扰素粗制液：聚乙二醇酯摩尔比1:5向溶液中加入聚乙二醇酯，聚乙二醇酯加入量为五
份，升温至4℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至12℃，搅拌反应2h，向溶
液中加入五份聚乙二醇酯，升温至25℃，搅拌反应2h，向溶液加入五份聚乙二醇酯，升温至
36℃，搅拌反应2h，完全反应后，加入0.75Μ的半胱甘氨酸终止反应，得到聚乙二醇酯修饰
的干扰素；
步骤五：取一份聚乙二醇酯修饰的干扰素，取适量去离子水作为溶剂，按照聚乙二醇酯
修饰的干扰素：烷基丁二酸酯磺酸钠摩尔比1:1向溶液中加入烷基丁二酸酯磺酸钠，用盐酸
调节pH为2.6，按照烷基丁二酸酯磺酸钠：α-氰基丙烯酸丁酯摩尔比1:2.5向溶液中加入α-
氰基丙烯酸丁酯，搅拌10min，再用NaOH调节溶液的pH为5.8，继续搅拌反应，用0.8μm微孔滤
膜除去大的纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋宏婷，
申请(专利权)人：宋宏婷，
类型：发明
国别省市：四川;51