本发明专利技术公开了一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒及其制备方法和在制备电化学免疫探针中的应用。本发明专利技术通过在微乳液中用镉离子、铅离子或铜离子分别交联海藻酸钠制备了纳米级的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜球形颗粒，且能产生可分辨电化学信号。本发明专利技术制备方法的特点是制备条件温和，无需外加信号物质即可直接用于标记。使用此海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒标记不同抗体制备的电化学免疫传感器，能够实现不分区的三靶标的同时检测。本发明专利技术的一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒免疫探针，以及由其制备得到的电化学免疫传感器在免疫传感领域将具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒的制备方法和在制备免疫探针中的应用，属于电化学传感器领域，它可以用于免疫分析和检测。
技术介绍
癌症是一类恶性肿瘤的统称。我国每年有300万人被确诊为癌症，并且这一数字还在逐年上升。癌症的治疗难度大，死亡率高，是困扰人类的难题之一。研究表明，早发现早治疗能够有效的提高癌症治愈率同时降低死亡率。癌症的早期筛查主要针对的是肿瘤标志物。肿瘤标志物通常由胚胎组织和肿瘤组织直接产生，它的浓度变化能够反应肿瘤的动态变化，并与瘤体大小和临床分期有关(JosephA.Ludwig,JohnN.Weinstein,BiomarkersinCancerStaging,PrognosisandTreatmentSelection,Nat.Rev.Cancer,2005,5,845–856.)。一种肿瘤标志物浓度的升高可能与多种癌症有关，而一种癌症可以分泌多种肿瘤标志物。因此，为了避免单一肿瘤标志物的检测引起“假阳性”，提高诊断准确率，降低测试费用，同时检测几种肿瘤标志物是目前研究的一个热点问题。电化学免疫分析技术是一种快速、经济、灵敏度高、可微型化的检测肿瘤标志物的分析方法(BhaskaraV.Chikkaveeraiah,AshwinkumarA.Bhirde,NicoleY.Morgan,HenryS.Eden,XiaoyuanChen,ElectrochemicalImmunosensorsforDetectionofCancerProteinBiomarkers,ACSNano,2012,6,6546–6561.)。实现多组分同时检测的电化学免疫分析技术主要有以下两种。一种是基于位置分辨的阵列方法，此方法通常需要特殊的多通道工作电极，如溅射沉积电极或热解石墨电极等，这些电极材料为一次性材料，导致测试成本高并产生大量废弃物。另一种是基于标志物分辨的多探针标记方法，即在不同的二级抗体上标记不同的电化学活性信号物质，构建夹心型电化学传感界面，直接在一根电极上实现多种肿瘤标志物的同时检测。后者的优点在于电极可以反复使用，能有效降低成本节约资源。构建电化学免疫传感器的常用电化学活性物质有二茂铁类聚合物，硫堇、甲苯胺蓝、普鲁士蓝等有机染料类，醌、酚、醚等聚合物类，由于这类物质难以与抗体直接结合进行标记，通常需要键合亲水官能团进行改性，或借助纳米材料作为支撑体制成复合材料，间接标记抗体，制备过程复杂。Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+等过渡金属类，具有特征的氧化还原电极电势，常在溶出伏安方法中用作电活性信号物质，但需要强酸溶解，并在电极上镀汞膜富集，过程繁琐。海藻酸钠是由α-L-古洛糖醛酸(G单元)和β-D-甘露糖醛酸(M单元)两种结构单元构成无支链的嵌段共聚物，是一种天然的多糖。它的生物相容性好，并具有很好的亲水性，并含有大量的官能团如羧基和羟基，常用于蛋白细胞等生物活性物质的包埋。G单元上的Na+与二价金属离子发生离子交换后，使G集团堆积交联成网状结构，发生不可逆的凝胶化作用。利用此作用可以制备海藻酸交联二价离子的微球。目前制备海藻酸微球的方法主要有：滴注法、乳化法、溶剂蒸发法、高压静电液滴法和喷雾干燥法。这些方法制备的海藻酸微球都在微米级别，目前制备粒径均匀、球形度好、纳米级别的海藻酸微球，依然是有待解决的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球及其制备方法；本专利技术的目的之二在于提供一种由所述新型海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备得到的藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针；本专利技术的目的之三在于提供一种由藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针制备得到的电化学免疫传感器。本专利技术的上述目的是通过以下技术手段实现的：本专利技术在微乳液中利用二价金属离子Cd2+、Pb2+或Cu2+分别与海藻酸钠交联，形成海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。这种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球，用戊二醛活化后可以直接偶联抗体制成免疫探针，其中的二价金属离子产生特征的可分辨的电化学信号峰，金属离子的氧化还原峰与标记的抗体建立一一对应的关系，峰高与检测的抗原的浓度有关，从而实现三种肿瘤标志物的同时监测。本专利技术的一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过以下方法制备得到：(1)将1-3g曲拉通，0.5-1.5g正己醇，4-6g正辛烷，1-2mL海藻酸钠水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液1；(2)将1-3g曲拉通，0.5-1.5g正己醇，4-6g正辛烷，与1-2mLCdCl2水溶液、Pb(NO3)2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液2；(3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应1-6h，产物离心，沉淀用去离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。在本专利技术中，优选的，步骤(1)所述的海藻酸钠的水溶液的质量百分比浓度为1-2％。在本专利技术中，优选的，步骤(2)所述的CdCl2的水溶液的浓度为0.1-2.0M，Pb(NO3)2的水溶液的浓度为0.1-2.0M，CuCl2的水溶液的浓度为0.1-2.0M。本专利技术方法简单，且制备得到纳米尺寸的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜微球，具有可分辨的金属离子的电化学信号峰。因此使用该海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备的免疫探针制备电化学免疫传感器，可以实现三种肿瘤标志物的同时检测。因此，进一步的，本专利技术还提出了所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球在制备海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针中的应用。本专利技术的一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在于通过以下方法制备得到：(1)将以上所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、分散；(2)将海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；(3)室温下，将活化的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球分别与抗体溶液偶联，离心除去上清液；(4)沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针于4℃储存。在本专利技术中，优选的，步骤(2)中所用戊二醛的质量百分比浓度为5-15％。更进一步的，本专利技术还提出了所述的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针在制备电化学免疫传感器中的应用。按照本专利技术所述的方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过以下方法制备得到：(1)将1‑3g曲拉通，0.5‑1.5g正己醇，4‑6g正辛烷，1‑2mL海藻酸钠水溶液混合搅拌30‑90min制备成均匀的微乳液1；(2)将1‑3g曲拉通，0.5‑1.5g正己醇，4‑6g正辛烷，与1‑2mL的CdCl2水溶液、Pb(NO3)2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30‑90min制备成均匀的微乳液2；(3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应1‑6h，产物离心，沉淀用去离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。
【技术特征摘要】
1.一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过以下方
法制备得到：
(1)将1-3g曲拉通，0.5-1.5g正己醇，4-6g正辛烷，1-2mL海藻酸钠水溶
液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液1；
(2)将1-3g曲拉通，0.5-1.5g正己醇，4-6g正辛烷，与1-2mL的CdCl2水溶液、Pb(NO3)2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳
液2；
(3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应1-6h，产物离心，
沉淀用去离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。
2.如权利要求1所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征
在于：步骤(1)所述的海藻酸钠的水溶液的质量百分比浓度为1-2％。
3.如权利要求1所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征
在于：步骤(2)所述的CdCl2的水溶液的浓度为0.1-2.0M，Pb(NO3)2的水溶液
的浓度为0.1-2.0M，CuCl2的水溶液的浓度为0.1-2.0M。
4.权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球在
制备海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针中的应用。
5.一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在于通
过以下方法制备得到：
(1)将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球
用去离子水洗涤、分散；
(2)将海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨
基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
(3)室温下，将活化的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球分别与抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：马占芳，王子凤，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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