一株特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株2F6及其应用制造技术

一株特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株2F6及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术单克隆细胞株2F6已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10874。本发明专利技术将原药丙烯酰胺与对巯基苯甲酸采用化学衍生加成制备半抗原，半抗原与BSA偶联制备免疫原，半抗原与OVA偶联制备包被原。对小鼠进行免疫后得到一株特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株2F6。此细胞株2F6分泌的单克隆抗体，仅特异性针对衍生化丙烯酰胺，与丙烯酰胺本身、对巯基苯甲酸交叉率分别为2.19%、3.87%。本发明专利技术获得的抗丙烯酰胺单克隆抗体细胞株，有较好的检测灵敏度和亲和力，可以达到特异性检测丙烯酰胺的目的。本发明专利技术提供一种新的丙烯酰胺衍生化方法，半抗原的合成步骤简单、高效，用以得到很好的特异性单克隆抗体细胞株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株2F6及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
丙烯酰胺(AA)，英文名称为Acrylamide，分子式为C3H5NO，分子量为71.08，CAS登录号为79-06-1。淀粉类食品在高温(>120℃)烹调下容易产生丙烯酰胺。研究表明，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺。丙烯酰胺进入体内又可通过多种途径被人体吸收，其中经消化道吸收最快。进入人体内的丙烯酰胺约90%被代谢，仅少量以原形经尿液排出。丙烯酰胺进入体内后，会在体内与DNA上的鸟嘌呤结合形成结合物，导致基因突变等遗传物质损伤。国际癌症研究中心对丙烯酰胺的致癌性进行了评价并将其列为二类致癌物，即人类可疑致癌物。对接触丙烯酰胺的职业人群和偶然暴露于丙烯酰胺人群的调查表明丙烯酰胺还具有神经毒性作用。2002年4月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学研究人员率先报道，在一些油炸和烧烤的淀粉类食品，如炸薯条、炸土豆片等中检出丙烯酰胺，而且含量超过饮水中允许最大限量的500多倍。所以有必要建立丙烯酰胺的快速检测方法。目前丙烯酰胺的检测方法主要是仪器检测方法和免疫分析检测方法，仪器检测方法仪器成本高，操作复杂，需要专职人员操作。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对丙烯酰胺具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立丙烯酰胺酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析技术快速检测方法。本专利技术的技术方案，一株特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株2F6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.10874。抗丙烯酰胺单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.10874的特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株2F6分泌产生。所述抗丙烯酰胺单克隆抗体的应用，其在食品安全中丙烯酰胺残留检测中的应用。本专利技术提供的杂交瘤细胞株2F6细胞株的制备基本步骤为：（1）免疫原的制备与鉴定：将原药丙烯酰胺与对巯基苯甲酸（4-MBA）采用化学衍生加成法制备半抗原，通过LC-MS鉴定衍生产物，之后用活化酯法偶联蛋白，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；（2）小鼠的免疫：将抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株2F6；（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。本专利技术的有益效果：本专利技术获得的抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅有较好的检测灵敏度和亲和力，可以达到特异性检测丙烯酰胺的目的。本专利技术提供一种新的丙烯酰胺衍生化方法，半抗原的合成步骤简单、高效，用以得到很好的特异性单克隆抗体细胞株。生物材料样品保藏：一株特异性抗丙烯酰胺单克隆细胞株2F6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月19日，保藏编号为CGMCCNo.10874。附图说明图1是丙烯酰胺半抗原的LC-MS鉴定。图2是免疫原的紫外吸收光谱。1、BSA，2、AA-4-MBA，3、AA-4-MBA-BSA。图3是2F6单克隆抗体对丙烯酰胺AA的标准曲线图。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将丙烯酰胺完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对丙烯酰胺有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1：杂交瘤细胞株2F6的制备（1）完全抗原的合成：将15mg丙烯酰胺，20mg对巯基苯甲酸和12mg小苏打放入反应瓶中，加8mL水溶解，50℃反应1h，盐酸调pH=5，析出白色固体，过滤、水洗滤饼、干燥得产物，即丙烯酰胺半抗原。取5.2mg丙烯酰胺半抗原，加入2.5mgEDC和2.0mgNHS，使用DMF溶解，室温搅拌，活化4h；另取5mgBSA溶解于2mL、0.05M、pH9.6的CB溶液中，将上述活化后的丙烯酰胺半抗原溶液慢速逐滴加入BSA的CB溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，得免疫原，-20℃分装保存。丙烯酰胺半抗原LC-MS鉴定如图1所示，免疫原的紫外吸收光谱表征如图2所示。（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取丙烯酰胺完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免疫，准备融合。（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；c、将脾细胞和SP2/0细胞按照5~10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含体积百分比为20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，体积浓度为5%的CO2的培养箱中培养。（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含体积百分比为20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用AA、4-MBA、AA-4-MBA为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株2F6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10874。

【技术特征摘要】
1.一株特异性抗丙烯酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株2F6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.10874。
2.抗丙烯酰胺单克隆抗体，其特征在于：它由所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽强，朱雨婷，胥传来，匡华，徐丽广，马伟，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32