从海人树干燥叶片中提取高质量基因组DNA的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种海人树干燥叶片基因组DNA的提取方法，属于生物技术领域。具体而言，本发明专利技术提供的提取方法包括对干燥叶片细胞研磨破碎，两步法抽提DNA、杂质的去除以及DNA的纯化。采用本发明专利技术提供的提取方法能够有效的去除干燥组织样本中富含的多酚、多糖等次生代谢产物，最终获得高质量的基因组DNA。本发明专利技术在DNA提取方法中加入了聚乙烯吡咯烷酮，可更加有效的去除多酚类物质，使基因组DNA质量显著提高。本发明专利技术适用于海人树等乔木科植物干燥叶片基因组DNA的提取。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及植物基因组DNA分离提取技术，尤其涉及一种海人树干燥叶片基因组DNA的提取方法。
技术介绍
细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为基因组DNA。植物gDNA的提取主要用于基因文库构建、PCR分析及Southern杂交等，gDNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前，已经发展了多种方法，可成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出gDNA。但是有些情况下，不同植物甚至是同一种植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异,在提取gDNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理[1]，综合以往的提取经验，从干燥的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类新鲜组织。从干燥组织中分离出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质与DNA结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低、质量差、易降解，影响了DNA质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增[2]。针对这一现象，已有许多学者对植物特别是顽拗型木本植物的gDNA提取纯化进行了改良和发展，如K.Choudhary等[3]以豇豆作为材料，分别对新鲜叶片和干燥叶片进行了gDNA提取，并对干燥叶片的提取方法进行了改进，但效果都不是很明显。海人树为苦木科，海人树属的灌木或小乔木，通常分布于太平洋至印度洋热带地区的小孤岛或珊瑚岛上，在我国分布于台湾和广东的西沙群岛等地。目前对海人树的分子生物学研究较少，特别是对海人树干燥叶片的基因组DNA提取还未见报道，而采用常规的CTAB法提取基因组DNA时，最终获得的DNA质量普遍较差，影响后续试验的进行，严重时可能会导致最终分析结果失败。参考文献[1]CsaiklUM,BastianH,BrettschneiderRetal.ComparativeanalysisofdifferentDNAextractionprotocols.Afast,universalmaxi-preparationofhighqualityplantDNAforgeneticevaluationandphylogeneticstudies[J].PlantMolecularBiologyReporter,1998,61:69-86.[2]易庆平等，植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J].安徽农业科学，2007，35(25):7789-7791.[3]ChoudharyK,MathurN,ChoudharyOPandPillaiU.ProtocolforIsolationofgenomicDNAfromDryandFreshLeavesofVignaSpeciesSuitableforRapidandRestrictiondigestion[J].AdvancesinBiologicalResearch,2008,2(5-6):83-89.
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，针对海人树干燥叶片富含多酚、多糖的特点，提供了一种海人树干燥叶片基因组DNA的方法，利用该方法能够获得高质量的基因组DNA。本专利技术人为解决上述问题进行了深入的研究，结果发现：通过改良传统CTAB裂解液组分配比，并通过氯仿-异戊醇，以及Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇两步法抽提，可以实现高质量的提取海人树干燥叶片基因组DNA，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供的一种提取海人树干燥叶片高质量基因组DNA的方法，包括：1.一种海人树干燥组织高品质基因组DNA的提取方法，该方法包括下述步骤：步骤A：将样品在液氮下迅速冷冻并研磨成干粉；步骤B：将步骤A得到的干粉加入预热的裂解液中混匀，使样品悬浮，水浴裂解30～60分钟，取出混合液冷却至室温；其中，所述裂解液的组分包含3％(g/v)的CTAB，100mM的Tris-HCl，2M的NaCl，25mM的EDTA，5％(g/v)的PVP，以及4体积％的β-巯基乙醇；步骤C：将步骤B得到的混合液经氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液后，再经Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液；步骤D：将步骤C得到的上清液经沉淀剂沉淀并离心，再经洗涤液洗涤并离心后获得纯化的核酸；步骤E：将步骤D得到的纯化的核酸经干燥后，加入RNase消化RNA，获得消化RNA后的核酸溶液；步骤F：将步骤E获得的消化RNA后的核酸中加入无水乙醇沉淀基因组DNA，离心后弃上清液干燥后，加入溶解试剂，得到基因组DNA。2.根据项1所述的提取方法，步骤A使用的样品量为100～200mg。3.根据项1所述的提取方法，步骤B中裂解液的预热温度为65～75℃，水浴裂解的温度为65～75℃。4.根据项1所述的提取方法，其特征在于，步骤C中氯仿-异戊醇的体积比为24:1；Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇的体积比为25:24:1。5.根据项1所述的提取方法，其特征在于，步骤D中洗涤液为70～80％的乙醇，以及2～5M的NaCl。6.一种用于海人树干燥叶片基因组DNA的提取试剂盒，其包括CTAB裂解液、抽提试剂、以及核酸沉淀剂、洗涤剂和溶解剂；所述CTAB裂解液的组分包括3％(g/v)CTAB，100mMTris-HCl，2MNaCl，25mMEDTA，5％(g/v)PVP，以及4体积％β-巯基乙醇；所述抽提试剂包括体积比为24:1的氯仿-异戊醇，以及体积比为25:24:1的Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇。7.一种用于海人树干燥叶片DNA提取的改良CTAB裂解液，其特征在于，组分包含3％(g/v)CTAB，100mMTris-HCl，2MNaCl，25mMEDTA，5％(g/v)PVP，以及4体积％β-巯基乙醇。专利技术效果根据本专利技术，在传统CTAB裂解液中加入PVP，以及采用氯仿-异戊醇，以及Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇两步法抽提DNA，能够从海人树干燥叶片中提取高质量的基因组DNA。附图说明图1是本专利技术的实施例2的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M1为分子量标准，3为样品；图2是本专利技术的对比例1的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为分子量标准，3为样品。专利技术的具体实施方式本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。在一个方面，本专利技术提供了一种从海人树干燥叶片中提取高质量基因组DNA的方法，该方法包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海人树干燥叶片高质量基因组DNA的提取方法，该方法包括下述步骤：步骤A：将样品在液氮下迅速冷冻并研磨成粉末；步骤B：将步骤A得到的粉末加入预热的裂解液中混匀，水浴裂解30～60分钟，取出混合液冷却至室温；其中，所述裂解液的组分包含3％的CTAB，100mM的Tris‑HCl，2M的NaCl，25mM的EDTA，5％的PVP，以及4体积％的β‑巯基乙醇；步骤C：将步骤B得到的混合液经氯仿‑异戊醇抽提离心获得上清液后，再经Tris饱和苯酚‑氯仿‑异戊醇抽提离心获得上清液；步骤D：将步骤C得到的上清液经沉淀剂沉淀并离心，再经洗涤液洗涤并离心后获得纯化的核酸；步骤E：将步骤D获得的纯化的核酸经干燥后，加入RNase消化RNA，获得消化RNA后的核酸溶液；步骤F：将步骤E获得的消化RNA后的核酸溶液中加入无水乙醇沉淀基因组DNA，离心弃上清液并干燥后，加入溶解试剂，得到基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种海人树干燥叶片高质量基因组DNA的提取方法，该方法包括下述步
骤：
步骤A：将样品在液氮下迅速冷冻并研磨成粉末；
步骤B：将步骤A得到的粉末加入预热的裂解液中混匀，水浴裂解30～60
分钟，取出混合液冷却至室温；
其中，所述裂解液的组分包含3％的CTAB，100mM的Tris-HCl，2M的NaCl，
25mM的EDTA，5％的PVP，以及4体积％的β-巯基乙醇；
步骤C：将步骤B得到的混合液经氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液后，再
经Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇抽提离心获得上清液；
步骤D：将步骤C得到的上清液经沉淀剂沉淀并离心，再经洗涤液洗涤并
离心后获得纯化的核酸；
步骤E：将步骤D获得的纯化的核酸经干燥后，加入RNase消化RNA，获
得消化RNA后的核酸溶液；
步骤F：将步骤E获得的消化RNA后的核酸溶液中加入无水乙醇沉淀基因
组DNA，离心弃上清液并干燥后，加入溶解试剂，得到基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的提取方法，步骤A所述样品的起始量为100～200mg。
3.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏少华，韩改革，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11