一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于免疫学检测方法领域，目的在于提供一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法，该方法包括DIBO标记ssDNA的合成、Insulin单克隆抗体的生物素修饰、Insulin单克隆抗体的ssDNA修饰Immuno-PCR微孔板的制备、Insulin的Immuno-PCR标准曲线的制定等步骤。本发明专利技术通过抗体修饰技术在免疫PCR反应中的应用，可以进行超低浓度生物素标志物的检测，可以超过传统ELISA方法1000倍的灵敏度可以允许检测浓度极低的生物标志物。

Reagent kit for detecting immune PCR reaction by using antibody and detection method

The invention belongs to the field of immunological detection methods, the purpose is to provide a modified immune response using PCR antibody detection kit and detection method, the method includes the steps of making the DIBO labeled ssDNA synthesis, Insulin monoclonal antibody and biotinylated Immuno-PCR standard curve preparation and Insulin of monoclonal antibodies against Insulin ssDNA modified Immuno-PCR microplate the. The present invention by antibody modified technique in PCR immunoreactivity in the application can be very low concentrations of biotin markers, the sensitivity can be more than 1000 times of traditional ELISA method can allow detection of very low concentrations of biomarkers.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学检测方法领域，具体涉及一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
ELISA检测技术从其专利技术之日起就在临床和科研市场中得到越来越广泛的应用(Lequin,R.M.(2005).EnzymeImmunoassay(EIA)/Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA).ClinicalChemistry51,2415–2418.)。随着越来越精细的检测需求，终端用户在体外诊断的灵敏度、动态范围和多通道检测能力等方面有了越来越高的要求。基于抗体检测的技术也越来越多样化，出现了很多新技术。根据技术路线和需求的不同分为以下几类：1.灵敏度的提升。经过多年的技术升级和成熟，目前ELISA技术的灵敏度已经达到极限。现有的尝试也都是基于检测方法的改进来提升灵敏度，比如采用创新型微孔板技术的SiloamBiosciences公司(http://siloambio.com/)和应用微珠技术的Quanterix公司(http://www.quanterix.com/)。2.多通道检测。Luminex公司专利技术的像xMAPMultiplexing技术理论上可以最多支持500种分析物的同时检测(http://www.luminexcorp.com/TechnologiesScience/xMAPTechnology/)。这种技术也是利用barcode的微珠标记上不同抗体来检测样本中的多种分析物。实际开发中可以达到20种左右的生物标志物同时检测。3.液相ELISA技术(Bidinosti,M.,Shimshek,D.R.,Mollenhauer,B.,Marcellin,D.,Schweizer,T.,Lotz,G.P.,Schlossmacher,M.G.,andWeiss,A.(2012).Novelone-stepimmunoassaystoquantifyá-synuclein:applicationsforbiomarkerdevelopmentandhigh-throughputscreening.J.Biol.Chem.287,33691–33705.)。将检测抗原的两种单抗分别标记不同的微珠或者荧光基团，利用抗体和抗原结合时将两种不同的微珠靠近或者荧光基团发生共振能量转移(FRET)可以实现被检标志物的液相检测。这种检测方法不再需要多步清洗而直接检测，减少了检测时间和自动化的难度。4.ELISA技术微型化(Ng,A.H.C.,Uddayasankar,U.,andWheeler,A.R.(2010).Immunoassaysinmicrofluidicsystems.AnalBioanalChem397,991–1007.)。很多研究将ELISA微型化至微流体芯片上从而实现ELISA实验的微型化和便携性。上述ELISA的改进都是在现有原理的基础上进行优化，因此也很难带来本质性的性能提升。Immuno-PCR的工作原理如图1所示。Immuno-PCR(免疫PCR)技术自1992年Sano等人专利技术以来(Sano,T.,Smith,C.L.,andCantor,C.R.(1992).Immuno-PCR:verysensitiveantigendetectionbymeansofspecificantibody-DNAconjugates.Science258,120–122.)，曾经一度被认为是可以像PCR一样检测蛋白质的技术，可惜受制于抗体修饰技术而一直未能获得商业上的成功。多年来抗体修饰一直依赖于间接修饰技术和直接化学修饰技术。前一种技术利用生物素Biotin随机修饰抗体表面，然后在通过链亲和素(Streptavidin)将Biotin修饰的DNA和抗体以非共价键的方式耦联。后一种是通过将抗体或者DNA活化之后与DNA或者抗体上的自由氨基反应达到共价耦联。不过不论哪种方法都是通过抗体上自由的氨基(比如Lysine)来实现的。这种耦联技术不但需要抗体在非活性的缓冲液中进行耦联，而且耦联的位点也充满随机性，常常由于抗原抗体结合区附近被耦联的DNA屏蔽从而导致了抗体特异性和亲和力的下降。这也是Immuno-PCR这么多年来在实例中灵敏度难以突破1000倍而且提升程度不一的原因。因此，科研和生产中均需要一种利用抗体修饰技术应用于Immuno-PCR反应的、灵敏度大大提高的检测试剂盒和检测方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法，该方法通过抗体修饰技术在免疫PCR反应中的应用，可以进行超低浓度生物素标志物的检测。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，包括：带DIBO标记的核酸修饰的检测抗体、包被有带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体的Immuno-PCR微孔板、用于扩增核酸的引物对、荧光定量染料混合体系。进一步地，所述核酸为ssDNA；该ssDNA的DNA序列包括SEQIDNo.1，用于扩增该ssDNA的引物对的DNA序列包括SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。进一步地，所述荧光定量染料混合体系包括：耐热聚合酶反应缓冲液、镁离子、dNTP、参考染料、PCR扩增用DNA聚合酶、DNA结合染料。本专利技术的目的是通过以下另一技术方案实现的：一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，包括如下步骤：DIBO标记ssDNA的合成步骤：先通过DNA序列随机合成网站生产ssDNA序列(SEQIDNo.1)，再合成带DIBO标记的ssDNA；捕捉抗体的生物素修饰步骤：将捕捉抗体利用带DIBO标记的生物素进行生物素修饰，得到带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体；检测抗体的ssDNA修饰步骤：将检测抗体利用所述带DIBO标记的ssDNA进行ssDNA修饰，得到带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体；Immuno-PCR微孔板的制备步骤：用所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体包被链亲和素PCR微孔板，再将该微孔板经过孵育、清洗，得到Immuno-PCR微孔板；待测样品的Immuno-PCR定量步骤：将待测样品和所述带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体混合之后，加入所述Immuno-PCR微孔板中；再经过孵育、清洗，加入能够特异扩增ssDNA的引物对(SEQIDNo.2和3)进行荧光定量PCR反应，再完成ssDNA的PCR定量。...

【技术保护点】
一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括：带DIBO标记的核酸修饰的检测抗体、包被有带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体的Immuno‑PCR微孔板、用于扩增核酸的引物对、荧光定量染料混合体系。

【技术特征摘要】
1.一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，其特征在于：所述检测
试剂盒包括：带DIBO标记的核酸修饰的检测抗体、包被有带DIBO标记的生
物素修饰的捕捉抗体的Immuno-PCR微孔板、用于扩增核酸的引物对、荧光
定量染料混合体系。
2.根据权利要求1所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，其特征
在于：所述核酸为ssDNA；该ssDNA的DNA序列包括SEQIDNo.1，用于
扩增该ssDNA的引物对的DNA序列包括SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。
3.根据权利要求1或2所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，其
特征在于：所述荧光定量染料混合体系包括：耐热聚合酶反应缓冲液、镁离
子、dNTP、参考染料、PCR扩增用DNA聚合酶、DNA结合染料。
4.一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，其特征在于：该方法包括
如下步骤：
DIBO标记ssDNA的合成步骤：先通过DNA序列随机合成网站生产
ssDNA序列(SEQIDNo.1)，再合成带DIBO标记的ssDNA；
捕捉抗体的生物素修饰步骤：将捕捉抗体利用带DIBO标记的生物素进行
生物素修饰，得到带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体；
检测抗体的ssDNA修饰步骤：将检测抗体利用所述带DIBO标记的
ssDNA进行ssDNA修饰，得到带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体；
Immuno-PCR微孔板的制备步骤：
用所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体包被链亲和素PCR微孔板，
再将该微孔板经过孵育、清洗，得到Immuno-PCR微孔板；
待测样品的Immuno-PCR定量步骤：
将待测样品和所述带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体混合之后，加
入所述Immuno-PCR微孔板中；再经过孵育、清洗，加入能够特异扩增ssDNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：程永升，吴雪萍，
申请(专利权)人：程永升，吴雪萍，
类型：发明
国别省市：上海;31