烟草25S RNA内参基因的克隆方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及烟草25S RNA（25S ribosomal RNA）内参基因序列、克隆方法及其应用。本发明专利技术所获得的25S RNA基因的部分核苷酸序列可作为研究烟草功能基因或不同组织、不同生长发育阶段以及不同激素处理条件下的基因表达分析的内参基因。利用该内参基因设计的实时荧光定量PCR引物扩增特异性强，能够提高烟草基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性。

25S RNA gene cloning method of tobacco and its application

The invention belongs to the technical field of molecular biology, in particular to tobacco (25S ribosomal RNA 25S RNA) gene sequence, cloning method and its application. The nucleotide sequence of RNA gene of 25S which is obtained by the invention can be used as tobacco function genes or in different tissues and different developmental stages and different hormone treatment conditions, gene expression gene analysis. Amplification specificity using real-time fluorescence quantitative PCR primer gene design of the internal control, which can improve the expression of stability, reliability and repeatability of the tobacco gene.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及烟草基因表达过程中所需的一种内参基因25SRNA。
技术介绍
烟草（NicotianatabacumL.）为茄科烟草属，含有尼古丁（Nicotine）的叶用一年生作物。人类使用烟草大约有1500年的历史，作为烟草工业的重要原料，将叶片采收后经过调制、分级、加工处理，制成卷烟、雪茄烟、斗烟、嚼烟及鼻烟等，供人嗜用。烟草是经典的基因工程研究模式作物之一，然而，在分析烟草基因表达过程中可供选择的内参基因并不多见。目前，文献中报道较多的有GAPDH、EF-1a，而在其他植物中广泛使用的内参基因，在烟草中并未得到明确的克隆和验证。同时，由于内参基因的选择存在不通用性，即不同物种间的内参基因存在差异性。这就要求在烟草中使用其他植物中的内参基因，要根据实验要求开展必要的稳定性评价与鉴定。随着基因芯片技术越来越成熟，大量的基因芯片数据为新内参基因的挖掘提供了良好的数据基础和平台，为内参基因的选择提供了更为广阔的空间。与传统同源性比对方法所获的内参基因相比较，通过基因芯片表达技术筛选到的内参具有高量表达和稳定表达的特性。实时荧光定量PCR(real-timequantitativereversetranscriptionPCR，qRT-PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。利用qRT-PCR分析基因表达水平是现在分子生物学中重要的研究手段，qRT-PCR具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点。在qRT-PCR中，对目标基因相对表达量的分析是通过内参基因的均一化来确定。因此，内参基因的选择是qRT-PCR的关键步骤。一个理想的内参基因应该是在不同发育阶段和不同组织器官中稳定表达，且表达量不受其他外界因素、实验处理条件的影响。迄今为止，尚未发现特别理想的内参基因。因此，研究者必须结合各自的实验条件和样品类型来选择合适的内参基因。25S核糖体（25SribosomalRNA）基因是常用的内参基因，由于核糖体RNA的合成独立于信使RNA，其基因转录水平稳定性更好，因此，25SRNA成为很多动植物基因表达分析中内参基因的重要选择对象。
技术实现思路
本专利技术提供烟草25SRNA基因部分序列，可作为烟草内参基因的应用。并同时提供克隆烟草25SRNA基因的特异性引物，建立基于SYBRGreen荧光染料技术的qRT-PCR方法，从而作为烟草25SRNA的内参基因，为利用实时荧光定量PCR对烟草基因表达分析的研究提供有用的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种烟草25SRNA基因序列的克隆方法，通过对烟草不同生长发育时期的99个不同组织样本的芯片表达数据分析，筛选出在所有样品中稳定表达的变异系数（coefficientofvariation，CV）较小的组成型25SRNA基因序列，以引物对25SRNA-F/25SRNA-R进行PCR扩增、获得阳性克隆，后经质粒测序验证。其中引物对序列如SEQIDNO.1/SEQIDNO.2所示。所获得的目的片段如SEQIDNO.3，大小为459bp。所述PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环。再72℃终延伸10min，4℃保存。本专利技术还提供一种qRT-PCR扩增烟草25SRNA基因部分序列的方法，以25SRNA的基因序列为基础，按照qRT-PCR引物设计的原则，设计出一对荧光定量特异引物。以烟草不同生长发育时期、不同组织器官以及不同激素处理条件下的20个样本的cDNA为模板，利用半定量PCR评估25SRNA基因表达水平的稳定性和可靠性之后，进一步进行实时荧光定量PCR扩增，荧光染料为SYBRGreen，其中qRT-PCR的定量引物，其序列如SEQIDNO.4/SEQIDNO.5所示。所述的qRT-PCR扩增反应程序如下：在95℃预变性10min，先运行40个循环再95℃变性15s，60℃退火30s，然后为检测PCR扩增基因的特异性，在PCR反应之后运用溶解曲线，扩增温度以0.5℃的增幅从65℃缓慢递增到95℃，每个增幅的时间为5s。本专利技术的有益效果在于：1．本专利技术首次克隆到烟草25SRNA基因，其稳定性和特异性经由半定量PCR和实时荧光定量PCR检测和验证；2．25SRNA基因不仅在烟草不同组织器官、不同生长发育阶段的组织中稳定表达，而且能够在各种激素处理条件下亦稳定表达。25SRNA基因稳定表达的特性，为烟草不同发育阶段、不同组织器官、不同激素处理相关基因表达的定量研究提供了新的高可信度的内参基因；3．经实验验证，本专利技术所设计的用于荧光定量PCR检测的引物亦可用于半定量PCR快速检测，且扩增特异性和稳定性良好。附图说明图1为本专利技术中烟草25SRNA基因扩增的1%琼脂糖凝胶电泳图；其中M为BM2000Marker，1为烟草25SRNA基因；图2为本专利技术的25SRNA基因在烟草不同生长发育阶段、不同组织器官中PCR扩增的1%琼脂糖凝胶电泳图；图3为本专利技术的25SRNA基因在烟草不同激素处理条件PCR扩增的1%琼脂糖凝胶电泳图；图4为本专利技术中25SRNA基因实时荧光定量PCR扩增曲线图；图5为本专利技术中25SRNA基因实时荧光定量PCR扩增的溶解曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。实施例1.一种烟草25SRNA基因序列的克隆方法1.1烟草总RNA提取：取约100mg烟草新鲜组织，在液氮中迅速研磨成粉末，加入相应量BB6（每1mLBB6，加10μLβ-巯基乙醇，现用现配），涡旋剧烈振荡混匀；室温孵育3min后，12000g离心2-5min，小心吸取离心管中的上清至RNase-free的离心管中；向上清中加入0.5倍体积无水乙醇，并涡旋彻底混匀，分散沉淀，再将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，以12000g离心30s，弃掉流出液后，加500μLCB6，室温12000g离心30s，弃掉流出液；向离心柱中央加入80μL的DNaseⅠ工作液，室温放置15min，重复该步骤一次，以除去基因组DNA；加500μLWB6，12000g离心30s，弃掉流出液；再12000g离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟，彻底晾干离心柱后，加50μLRNase-freeH2O在离心柱的中央，室温静置1min，12000g离心2min，洗脱RNA。将1μL原始样品稀释10倍或100倍后，取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整性检测。并取1μLRNA用微量紫外分光光度计（NanoDrop2000）测定RNA样品的纯度和浓度值。将合格样品置于-80℃保存待用。1.2PCR扩增引物序列25SRNA的上游引物如SEQIDNO.1所示；25SRNA的下游引物如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草25S RNA基因，其特征在于：所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草25SRNA基因，其特征在于：所述基因核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
2.一种烟草25SRNA基因的克隆方法，其特征在于：通过对烟草组织样本的芯片表达数据分析，筛选出25SRNA基因序列，以引物对25SRNA-F/25SRNA-R进行PCR扩增、获得阳性克隆，后经质粒测序验证；其中引物对序列如SEQIDNO.1/SEQIDNO2所示；所获得的目的片段如SEQIDNO.3，大小为459bp。
3.根据权利要求2所述的烟草25SRNA基因的克隆方法，其特征在于：通过对烟草不同生长发育时期的50~150个不同组织样本的芯片表达数据分析，筛选在所有样品中稳定表达且变异系数较小的组成型25SRNA基因序列。
4.根据权利要求2所述的烟草25SRNA基因的克隆方法，其特征在于：通过对烟草不同生长发育时期的99个不同组织样本的芯片表达数据分析。
5.根据权利要求2所述的烟草25SRNA基因的克隆方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环，再72℃终延伸10min，4℃保存。
6.一种烟草25SRNA基因的qRT-PCR扩增方法，其特征在于：以25SRNA的基因序列为基础，设计1~5对荧光定量特异引物，以10~30个烟草样本的cDNA为模板，进行qRT-PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢小东，秦广雍，杨军，魏攀，王中，李锋，武明珠，张剑锋，林福呈，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41