甲型流感病毒全基因组扩增方法及使用的复合引物和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种甲型流感病毒全基因组扩增方法及使用的复合引物和试剂盒，其中，复合引物包括2条正向引物和1条反向引物，正向引物F1的序列为：ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG-，正向引物F2的序列为：ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG，反向引物R的序列为：ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG；试剂盒内装有若干管反应液和反应复合酶，其中，反应液中含有前面记载的正向引物F1、正向引物F2和反向引物R。本发明专利技术的有益之处在于：本发明专利技术的复合引物对所有甲型流感病毒都具有良好的特异性；本发明专利技术的试剂盒应用方便，减少了人为误差，增加了试验的准确性，使得获得甲型流感病毒的全基因组产物变得更加容易；本发明专利技术的扩增方法不仅操作简单，而且特异性好、灵敏度高、检测快速(PCR反应时间小于4小时)、结果可靠。

Whole genome amplification method for influenza A virus and composite primer and kit for use

The invention discloses an influenza virus whole genome amplification method and using the composite primer and kit, which includes 2 positive composite primers primers and 1 reverse primers, the sequence of the forward primer F1 for ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG-, F2 for the forward primer sequence: ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG sequence, reverse primer R: ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG; reagent box is provided with a plurality of pipe reaction liquid and compound enzyme reaction, the reaction liquid contains forward primer F1, recorded in front of the forward primer F2 and reverse primer R. The invention has the advantages that the composite primer of the invention have good specificity for all influenza A virus; kit for the application of the invention is convenient, reduce human error and increase the accuracy of the test, the whole genome of influenza A virus products more easily amplified; the method of the invention is not only simple moreover, good specificity, high sensitivity, fast detection (PCR reaction time less than 4 hours) and the result is reliable.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种病毒的全基因组扩增方法，具体涉及一种甲型流感病毒的全基因组扩增方法，以及在该方法中所使用的复合引物和试剂盒，属于生物

技术介绍
甲型流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为A型、B型、C型。A型流感病毒根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型。A型流感病毒常引起世界性大流行。B型和C型流感病毒不分亚型。B型、C型流感病毒以局部暴发和散发流行为特征。禽流感(avianinfluenza，AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的一种家禽和野禽的疾病综合征，其病原禽流感病毒属正粘病毒科流感病毒属，为单股负链RNA病毒，根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同可分为16个HA亚型和9个NA亚型。目前，研究甲型流感病毒基因进化的主要技术需要对甲型流感病毒的8个基因节段分别进行扩增后再进行测序，不仅费事费力，而且对实验室和人员要求较高，通量低，不适用于大批量的样本测序。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种复合引物，该复合引物对所有甲型流感病毒都具有良好的特异性。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种用在甲型流感病毒全基因组扩增中的复合引物，其特征在于，包括2条正向引物和1条反向引物，其中，正向引物F1的序列为：ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG；正向引物F2的序列为：ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG；反向引物R的序列为：ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。本专利技术的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒能够使获得甲型流感病毒的全基因组产物变得更加容易。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种用在甲型流感病毒全基因组扩增中的试剂盒，试剂盒内装有若干管反应液和反应复合酶，其特征在于，前述反应液中含有前面记载的正向引物F1、正向引物F2和反向引物R。前述的试剂盒，其特征在于，前述反应液由以下成分组成：本专利技术的第三个目的在于提供一种甲型流感病毒全基因组扩增方法，该方法操作简单、特异性好、灵敏度高、检测快速、结果可靠。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种甲型流感病毒全基因组扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA；Step2：利用前面记载的试剂盒进行RT-PCR反应，扩增核酸；Step3：电泳扩增产物，并根据电泳图判断扩增结果。前述的扩增方法，其特征在于，在Step2中，扩增核酸的具体步骤为：(1)将试剂盒中的反应液混匀，离心，分装，41μl/孔；(2)向反应孔中加入提取的样品RNA，8μl/孔；(3)将试剂盒中的反应复合酶加入到反应孔中，1μl/孔；(4)震荡离心后上PCR机进行检测。前述的扩增方法，其特征在于，设置的PCR循环条件为：本专利技术的有益之处在于：一、经实验证明，本专利技术的复合引物对所有甲型流感病毒都具有良好的特异性，能快速有效的得到甲型流感病毒的全基因组产物；二、本专利技术的试剂盒应用方便，无需配置反应体系，减少了人为误差，增加了试验的准确性，使得获得甲型流感病毒的全基因组产物变得更加容易，而且保证了实验结果重复性更好；三、经实验证明，本专利技术的扩增方法不仅操作简单，而且特异性好、灵敏度高、检测快速(PCR反应时间小于4小时)、结果可靠，为临床诊断、检验检疫等领域的甲型流感病毒二代测序技术提供了简单可行的技术方案。附图说明图1是采用本专利技术的方法获得的甲型流感病毒8个基因节段扩增后结果图；图2是采用本专利技术的方法获得的不同亚型的流感病毒8个基因节段扩增后结果图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。一、引物与探针从NCBI上下载国内甲型流感病毒的全基因序列，平均每年两株。使用bioedit软件进行比对，选择8个基因节段两端的保守区域。引物探针设计使用商业软件Lasergene中的PrimerSelect软件，设计后的引物进行合成。最终，本专利技术设计得到了由2条正向引物和1条反向引物组成的复合引物，该复合引物的序列如下：正向引物F1的序列为：ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG；正向引物F2的序列为：ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG；反向引物R的序列为：ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。探针序列与目的基因负链的碱基序列一致。因为正向引物F1、正向引物F2和反向引物R是针对甲型流感病毒8个基因节段的两端保守区，所以本专利技术的复合引物对所有甲型流感病毒都具有良好的特异性，能快速有效的得到甲型流感病毒的全基因组产物。二、检测试剂盒试剂盒内装有若干管反应液和反应复合酶，其中，反应液中含有前面记载的正向引物F1、正向引物F2和反向引物R。1、反应液的成分和用量如下：2、反应复合酶的成分和用量如下：反应复合酶是逆转录酶和PCRTaq酶的混合物，二者等量混合。本专利技术的试剂盒应用方便，无需配置反应体系，减少了人为误差，增加了试验的准确性，使得获得甲型流感病毒的全基因组产物变得更加容易，而且保证了实验结果重复性更好。三、扩增方法1、提取流感病毒RNA利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA。具体步骤为：(1)取病毒采样液200μl；(2)加入500μl裂解液；(3)按RNeasyMiniKit(Qiagen公司，catalog#74104)说明书提取病毒RNA50μl。2、扩增核酸利用前面记载的检测试剂盒进行RT-PCR反应，扩增核酸。具体步骤为：(1)将试剂盒中的反应液混匀，离心，分装，41μl/孔；(2)向反应孔中加入提取的样品RNA，8μl/孔；(3)将试剂盒中的反应复合酶加入到反应孔中，1μl/孔；(4)震荡离心后上PCR机进行检测，设置的PCR循环条件为：3、电泳扩增产物采用常规方法电泳扩增产物，然后根据电泳图判断扩增结果，判断待检样本流感病毒8个基因节段扩增情况。扩增完全电泳图可见8条基因片段扩增不完全电泳图可见少于8条基因片段无效电泳图无扩增条带，结果无效图1是采用本专利技术的方法获得的甲型流感病毒8个基因节段扩增后结果图。图2是采用本专利技术的方法获得的不同亚型的流感病毒8个基因节段扩增后结果图。从图1和图2中的电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用在甲型流感病毒全基因组扩增中的复合引物，其特征在于，包括2条正向引物和1条反向引物，其中，正向引物F1的序列为：ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG；正向引物F2的序列为：ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG；反向引物R的序列为：ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。

【技术特征摘要】
1.一种用在甲型流感病毒全基因组扩增中的复合引物，其特征在于，包括2条正向引物
和1条反向引物，其中，
正向引物F1的序列为：ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG；
正向引物F2的序列为：ACGCGTGATCAGCGAAAGCAGG；
反向引物R的序列为：ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。
2.一种用在甲型流感病毒全基因组扩增中的试剂盒，试剂盒内装有若干管反应液和反
应复合酶，其特征在于，所述反应液中含有权利要求1中记载的正向引物F1、正向引物F2和
反向引物R。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液由以下成分组成：
4.一种甲型流感病毒全基因组扩增方...

【专利技术属性】
技术研发人员：李妍，
申请(专利权)人：新力合创北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11