一种芳香化酶基因工程菌及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种芳香化酶基因工程菌及构建方法，通过PCR技术克隆人类芳香化酶基因的主功能区并与毕赤酵母胞外表达质粒pPIC9K连接，通过电转化导入到毕赤酵母GS115中得到重组基因工程菌，利用构建好的基因工程菌发酵制备重组芳香化酶，并测定重组芳香化酶的酶活。本发明专利技术将人类芳香化酶基因整合到毕赤酵母染色体上，获得重组毕赤酵母，用该菌胞外活性表达芳香化酶。本发明专利技术涉及一种芳香化酶在毕赤酵母中胞外表达的方法，为芳香化酶的表达提供一种新的途径。

Aromatase gene engineering bacteria and construction method thereof

The invention discloses an aromatase gene engineering bacteria and construction methods of plasmid pPIC9K are connected by a main function area PCR cloning of the human aromatase gene and Pichia pastoris expression, by electroporation into Pichia pastoris GS115 recombinant gene engineering bacteria obtained by fermentation, gene engineering bacteria constructed by recombinant aromatase, and determination of recombinant aromatase enzyme activity. The present invention integrates human aromatase gene into Pichia pastoris chromosome and obtains recombinant Pichia pastoris. The invention relates to a method for extracellular expression of aromatase in Pichia pastoris, which provides a new way for the expression of aromatase.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因的克隆与表达领域，涉及一种芳香化酶基因工程菌及构建方法。
技术介绍
芳香化酶(Aromatase,CYP19)是细胞色素P450酶家族中的一员，是雌激素合成过程中最后一步的限速酶，能催化睾酮和雄烯二酮不可逆的转化为雌激素，是雌激素生物合成过程中的关键酶。现有研究表明，芳香化酶的表达及其功能的调节会使雌激素的生成量发生显著变化，同时可干扰局部或系统的雌激素水平。因此，芳香化酶成为治疗乳腺癌的理想靶点，也是用于检测芳香化酶抑制剂对芳香化酶的抑制活性的常用酶。在芳香化酶抑制剂研究中所用的芳香化酶多来源于胎盘，胎盘来源受限且芳香化酶是膜蛋白，难以分离纯化，因此芳香化酶基因的异源表达是大量获得芳香化酶的最佳方法。FZhang等人曾报道在大肠杆菌中表达过芳香化酶，但大肠杆菌在蛋白质翻译后缺乏加工机制，其表达的重组芳香化酶在大肠杆菌中以包涵体形式存在，需变性再复性才具有活性，收率低且步骤繁琐。Sigle和Nelson等人在昆虫细胞中表达过芳香化酶，Pompon等人在酿酒酵母中表达过芳香化酶，但他们所表达的芳香化酶均为胞内酶，不仅产率较低，遗传稳定性差，而且难以分离纯化。毕赤酵母在蛋白质翻译后能对蛋白进行加工、折叠、翻译后修饰等，毕赤酵母表达系统在试验操作上与大肠杆菌及酿酒酵母一样简单，而且它与昆虫细胞或酿酒酵母等其它真核表达系统相比表达水平更高。芳香化酶的N端前45个氨基酸为跨膜区，在异源胞外表达芳香化酶时常采用N端替换或删除前45个氨基酸的方法来实现。本专利技术采用PCR技术克隆了删减了N端前45个氨基酸残基的芳香化酶的主功能区并转入毕赤酵母中，以实现芳香化酶在毕赤酵母中的胞外表达。脊椎动物体内芳香化酶含量较低，不仅较难分离纯化，而且提取成本较高。原核表达产物缺乏芳香化酶催化活性，其表达产物必须经过变性后再复性才具有活性，收率低且步骤繁琐。昆虫细胞表达系统表达芳香化酶成本高且收率低，酿酒酵母表达系统表达芳香化酶容易过糖基化，且表达水平没有毕赤酵母高。本发明提供了一种芳香化酶在毕赤酵母中胞外活性表达的方法，为芳香化酶的表达提供一种新的途径。通过检索，目前尚未发现有在毕赤酵母中表达芳香化酶的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供芳香化酶基因工程菌及构建方法。本专利技术所构建的重组毕赤酵母基因工程菌具有良好的遗传稳定性，且表达的芳香化酶具有活性，为芳香化酶的产业化和在乳腺癌药物研发奠定了优良的基础。本专利技术实现目的的技术方案是：一种产芳香化酶的基因工程菌，工程菌的宿主菌为毕赤酵母，含有如序列1所述的芳香化酶的基因序列。而且，所述基因的载体为质粒pPIC9K-aromatase。产芳香化酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下⑴通过PCR技术克隆了人类芳香化酶基因，克隆的芳香化酶基因为删减了N端前45个氨基酸残基的芳香化酶的主功能区；⑵构建该基因的重组质粒并转入毕赤酵母中，将重组菌转接到培养基中培养并用甲醇诱导其高效表达；⑶发酵60小时后，分离菌体和发酵液，用超滤管初步浓缩发酵液；⑷通过SDS-PAGE蛋白电泳检测发酵液中是否有目的蛋白，最后按照相应的酶活测定方法检测重组蛋白的活性。本申请所述产芳香化酶的基因工程菌发酵获得的芳香化酶。本专利技术的优点和积极效果是：1、本专利技术提供了一种胞外表达芳香化酶的方法，该方法简单有效，构建的毕赤酵母基因工程菌成功的胞外表达了具有功能活性的芳香化酶，能为后期研究芳香化酶抑制剂提供所需蛋白。2、本专利技术所构建的重组毕赤酵母基因工程菌具有良好的遗传稳定性，且表达的芳香化酶具有活性，为芳香化酶的产业化和为抗乳腺癌药物的研发奠定了优良的基础。附图说明图1为重组质粒pPIC9K-aromatase的构建；图2为pMD19-T-aromatase重组质粒的单酶切验证；M：maker(10kb)，1：pMD19-T-aromatase单酶切结果；图3为pPIC9K-aromatase重组质粒的单酶切验证；M：maker(10kb)，1：pPIC9K-aromatase单酶切结果；图4为重组工程菌基因组PCR琼脂糖凝胶电泳检测图；M：maker(10kb)，1：工程菌基因组PCR电泳结果；图5为重组菌发酵液和PichiapastorisGS115发酵液的SDS-PAGE检测图；M：maker(245KD)，1：重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K–aromatase的发酵液，GS115：P.pastorisGS115/pPIC9K发酵液。图6为重组芳香化酶对MFC转化的测定结果。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术方法。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。本专利技术根据BulunSE等报道的基因序列，通过PCR技术克隆了人类芳香化酶基因，芳香化酶的N端前45个氨基酸残基为膜结合多肽，本专利技术所克隆的芳香化酶基因为删除N端前45个氨基酸残基的芳香化酶的主功能区。构建该基因的重组质粒并转入毕赤酵母中，将重组菌转接到培养基中培养并用甲醇诱导其高效表达，发酵60小时后，分离菌体和发酵液，用超滤管初步浓缩发酵液，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测发酵液中是否有目的蛋白，最后按照相应的酶活测定方法检测重组蛋白的活性。具体操作方式及步骤如下：实施例1：人类芳香化酶基因的克隆根据BulunSE等报道的基因序列，通过PCR技术克隆了删除N端前45个氨基酸残基的芳香化酶基因的主功能区，并分别设计了上下游引物9KD45F-SnaBI和9KD45R-NotI。并在该引物的末端添加了SnaBI和NotI限制性酶切位点。9KD45F-SnaBI：5＇-TACGTAAGCATCCCGGGTCCGGGCTAC-3＇9KD45R-NotI：5＇-GCGGCCGCTTAATGTTCCAGACAACGATCACTGTTG-3＇以人类芳香化酶基因为模板，通过PCR技术克隆了删减了N端前45个氨基酸的芳香化酶的主功能区。PCR扩增条件为：94℃5分钟，94℃30秒，64℃40秒，72℃90秒，30个循环，72℃延伸10分钟。实施例2：毕赤酵母胞外表达的重组质粒的构建将PCR产物与载体质粒PMD19-T进行连接反应，再将载体转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产芳香化酶的基因工程菌，其特征在于：工程菌的宿主菌为毕赤酵母，含有如序列1所述的芳香化酶的基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种产芳香化酶的基因工程菌，其特征在于：工程菌的宿主菌为毕赤酵
母，含有如序列1所述的芳香化酶的基因序列。
2.根据权利要求1所述的产芳香化酶的基因工程菌，其特征在于：所述基
因的载体为质粒pPIC9K-aromatase。
3.产芳香化酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下
⑴通过PCR技术克隆了人类芳香化酶基因，克隆的芳香化酶基因为删除N
端前...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴玉杰，钟永辉，张会图，孙同韦，刘少丹，张秀利，宋智丹，刘艳春，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12