一种含紫杉醇培养组合物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种含紫杉醇培养组合物及其制备方法，制备方法包括：将无花果曲霉菌种子液接入含有南方红豆杉和蛇六谷的红豆杉固态发酵培养基中培养，然后置于交变磁场环境中再培养，得红豆杉固态发酵产物，再经亚临界水萃取，得到红豆杉发酵亚临界萃取物Ⅰ；将产紫杉醇内生真菌种子液接入含有萃取剩余物Ⅱ的内生真菌液体发酵培养基中培养，得到内生真菌发酵产物Ⅲ；组合物为红豆杉发酵亚临界萃取物Ⅰ和内生真菌发酵产物Ⅲ，具有良好的护肝功能。其制备该方法能够有效地将各原料中的营养成分和有效成分进行生物降解和转化，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。

Taxol containing culture composition and preparation method thereof

The invention discloses a culture containing paclitaxel composition and a preparation method thereof. The preparation method comprises: the medium will be from Aspergillus seed liquid containing Taxus access and sheliugu Taxus solid-state fermentation, and then placed in an alternating magnetic field environment and culture, to Taxus solid-state fermentation by subcritical water extraction. The fermentation extract of Taxus chinensis by subcritical 1; the taxol producing endophytic fungi seed liquid extraction residue containing access of endophytic fungi in liquid fermentation medium by endophytic fungi fermentation products III; composition for the fermentation extract of Taxus subcritical and endophytic fungi fermentation products III, with good liver function. The method can effectively carry out the biological degradation and transformation of the nutrient components and the effective components of the raw materials, and is helpful to improve the content and activity of the active components in the final product.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物发酵领域，具体涉及一种含紫杉醇培养组合物及其制备方法。
技术介绍
紫杉醇(Paclitaxel)是一种四环二萜类天然抗癌药物，1963年美国化学家瓦尼(M.C.Wani)和沃尔(MonreE.Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉(PacificYew)树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。紫杉醇的制备多采用传统的提取、分离方法，一般包括a、萃取，以红豆杉为原料获得含有紫杉醇的提取物；b、去除胶质，除去提取物中的胶质杂质；c、分离纯化。微生物发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵一般较传统的化学提取方法绿色安全，因而近些年被广泛应用。紫杉醇的微生物发酵培养方法如：中国专利ZL200810152499.2公开了一种利用双液相发酵提高真菌产紫杉醇的方法，其包括在培养基中培养产紫杉醇真菌拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)NK17，当菌体生长达到平台期，加入有机溶剂继续培养，以使在所述菌株细胞内和所述培养基中更多地产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。该方法紫杉醇产率可达551.72μg/L。如能开发新的紫杉醇产品及其微生物发酵方法，将有望为紫杉醇或含紫杉醇的产品的制备提供新的途径。
技术实现思路
本专利技术提供了一种含紫杉醇培养组合物，该组合物中活性成分紫杉醇的含量和活性高，具有良好的护肝功效。本专利技术还提供了一种含紫杉醇培养组合物的制备方法，利用多种真菌发酵南方红豆杉和蛇六谷，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性，得到具有良好护肝功能的组合物。本专利技术发现，通过本专利技术特定的真菌发酵及特定的工艺，能够有效地将红豆杉中的营养成分和有效成分进行生物降解和转化，使各原料资源得到充分的利用，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。本专利技术采用的技术方案是：一种含紫杉醇培养组合物的制备方法，包括步骤：(1)取活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4h-6h，离心收集第一菌体；将第一菌体悬浮在含胆盐的液体MRS培养基中于20℃-30℃孵育3h-40h，离心收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀，在20℃-30℃培养2天-10天，得到产紫杉醇内生真菌种子液；(2)取活化后的无花果曲霉菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4h-6h，离心收集第三菌体，将第三菌体悬浮在含NaCl的液体MRS培养基中于20℃-28℃孵育0.5h-3h，离心收集第四菌体；将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第四菌体液，将第四菌体液接种到含NaCl的液体MRS培养基中于20℃-28℃培养5h-30h，得到无花果曲霉菌种子液；(3)将步骤(2)的无花果曲霉菌种子液接入红豆杉固态发酵培养基中，在16℃-30℃培养3天-30天，然后置于交变磁场环境中再培养5天-20天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得红豆杉固态发酵产物；所述红豆杉固态发酵培养基中含有南方红豆杉和蛇六谷；(4)将步骤(3)的红豆杉固态发酵产物经亚临界水萃取，得到红豆杉发酵亚临界萃取物Ⅰ，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物Ⅱ；(5)将步骤(1)的产紫杉醇内生真菌种子液接入内生真菌液体发酵培养基中，调pH值为3-7，在15℃-25℃培养5天-25天，离心，得到内生真菌发酵产物Ⅲ；所述内生真菌液体发酵培养基中含有萃取剩余物Ⅱ；所述含紫杉醇培养组合物为红豆杉发酵亚临界萃取物Ⅰ和内生真菌发酵产物Ⅲ。本专利技术进行固态发酵时，直接采用经含NaCl的液体MRS培养基两步孵育处理的无花果曲霉菌种子液，能够有效地将红豆杉中的营养成分和有效成分进行生物降解和转化，同时采用复配的南方红豆杉和蛇六谷，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。步骤(4)和步骤(5)中，将红豆杉固态发酵产物进行亚临界水萃取，使萃取物中有效成分的活性得以最大程度保留、含量得以大幅提高；再将萃取后的残渣作为内生真菌液体发酵主要的培养基，且采用经含胆盐的液体MRS培养基孵育处理的产紫杉醇内生真菌种子液，通过一体化循环利用，使各原料资源得到充分的利用，进一步提高了最终产品中活性成分的含量和活性。为了达到更好的效果，优选：步骤(1)中，所述含胆盐的液体MRS培养基中胆盐的质量百分含量为0.1％-0.5％。所述第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3。步骤(2)中，所述含NaCl的液体MRS培养基中NaCl的质量百分含量为2％-6％。所述第三菌体与用于悬浮第三菌体的含NaCl的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第四菌体与用于悬浮第四菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第四菌体液的接种量为1％-2％。步骤(3)中，所述南方红豆杉可采用南方红豆杉的枝叶；所述蛇六谷可采用蛇六谷的块茎。所述红豆杉固态发酵培养基每1L中含有5.5g-9.0g南方红豆杉和0.3g-3.0g蛇六谷。所述红豆杉固态发酵培养基由南方红豆杉、蛇六谷和发酵基础培养基组成，所述发酵基础培养基采用本领域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。所述红豆杉固态发酵培养基的制备方法，包括：将新鲜南方红豆杉、蛇六谷在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；再将5.5g-9.0g南方红豆杉和0.3g-3.0g蛇六谷用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到红豆杉固态发酵培养基。所述无花果曲霉菌种子液的接入量为红豆杉固态发酵培养基体积的5％-25％。目前产紫杉醇内生真菌发酵技术普遍存在发酵周期长、菌丝生长萌发慢、特征次生代谢产物含量低等问题。本专利技术发现将交变磁场处理技术应用于固态发酵中，通过特定培养时期的适当处理等外界因素有效刺激，提高真菌菌丝在南方红豆杉和蛇六谷培养基料上的生长代谢，缩短发酵时间，有效促进次生代谢产物的生成。所述交变磁场环境中磁场强度为0.2mT-6mT，磁场频率为3Hz-40Hz。步骤(4)中，所述亚临界水萃取的条件为：水料质量比为15-50:1，萃取压力在5MPa-20MPa，萃取温度为100℃-180℃，萃取时间为10min-60min。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含紫杉醇培养组合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：(1)取活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4h‑6h，离心收集第一菌体；将第一菌体悬浮在含胆盐的液体MRS培养基中于20℃‑30℃孵育3h‑40h，离心收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀，在20℃‑30℃培养2天‑10天，得到产紫杉醇内生真菌种子液；(2)取活化后的无花果曲霉菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4h‑6h，离心收集第三菌体，将第三菌体悬浮在含NaCl的液体MRS培养基中于20℃‑28℃孵育0.5h‑3h，离心收集第四菌体；将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第四菌体液，将第四菌体液接种到含NaCl的液体MRS培养基中于20℃‑28℃培养5h‑30h，得到无花果曲霉菌种子液；(3)将步骤(2)的无花果曲霉菌种子液接入红豆杉固态发酵培养基中，在16℃‑30℃培养3天‑30天，然后置于交变磁场环境中再培养5天‑20天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得红豆杉固态发酵产物；所述红豆杉固态发酵培养基中含有南方红豆杉和蛇六谷；(4)将步骤(3)的红豆杉固态发酵产物经亚临界水萃取，得到红豆杉发酵亚临界萃取物Ⅰ，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物Ⅱ；(5)将步骤(1)的产紫杉醇内生真菌种子液接入内生真菌液体发酵培养基中，调pH值为3‑7，在15℃‑25℃培养5天‑25天，离心，得到内生真菌发酵产物Ⅲ；所述内生真菌液体发酵培养基中含有萃取剩余物Ⅱ；所述含紫杉醇培养组合物为红豆杉发酵亚临界萃取物Ⅰ和内生真菌发酵产物Ⅲ。...

【技术特征摘要】
1.一种含紫杉醇培养组合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)取活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到液体MRS培养基中培
养4h-6h，离心收集第一菌体；将第一菌体悬浮在含胆盐的液体MRS培养
基中于20℃-30℃孵育3h-40h，离心收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓
冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀，在20℃-30℃
培养2天-10天，得到产紫杉醇内生真菌种子液；
(2)取活化后的无花果曲霉菌菌种接种到液体MRS培养基中培养
4h-6h，离心收集第三菌体，将第三菌体悬浮在含NaCl的液体MRS培养
基中于20℃-28℃孵育0.5h-3h，离心收集第四菌体；将第四菌体经PBS
缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到第四菌
体液，将第四菌体液接种到含NaCl的液体MRS培养基中于20℃-28℃培
养5h-30h，得到无花果曲霉菌种子液；
(3)将步骤(2)的无花果曲霉菌种子液接入红豆杉固态发酵培养基
中，在16℃-30℃培养3天-30天，然后置于交变磁场环境中再培养5天-20
天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得红豆杉固态发酵产物；所述红豆
杉固态发酵培养基中含有南方红豆杉和蛇六谷；
(4)将步骤(3)的红豆杉固态发酵产物经亚临界水萃取，得到红豆
杉发酵亚临界萃取物Ⅰ，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩
余物Ⅱ；
(5)将步骤(1)的产紫杉醇内生真菌种子液接入内生真菌液体发酵
培养基中，调pH值为3-7，在15℃-25℃培养5天-25天，离心，得到内
生真菌发酵产物Ⅲ；所述内生真菌液体发酵培养基中含有萃取剩余物Ⅱ；
所述含紫杉醇培养组合物为红豆杉发酵亚临界萃取物Ⅰ和内生真菌
发酵产物Ⅲ。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所
述红豆杉固态发酵培养基每1L中含有5.5g-9.0g南方红豆杉和0.3g-3.0g
蛇六谷。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：程俊文，贺亮，胡传久，魏海龙，方茹，邹景泉，李海波，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33