重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法技术

本发明专利技术公开一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，以植物乳杆菌ZJQ基因组为模板，PCR扩增plnD目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经NcoI和Hind III双酶切后纯化，16℃连接过夜，得到重组质粒pNZ8048-plnD。本发明专利技术构建的重组质粒pNZ8048-PlnD，能在植物乳杆菌ZJ316（缺乏调控蛋白PlnC和PlnD）中表达。该体系有助于研究和探讨PlnC在植物乳杆菌ZJ316中的转录调节机制，进而有助于揭示PlnD对植物乳杆菌ZJ316细菌素合成代谢调节机制，为植物乳杆菌ZJ316群体感应模式研究提供理论依据，也为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌ZJ316细菌素的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。

Method for constructing recombinant plasmid pNZ8048-plnD

The invention discloses a method for constructing the recombinant plasmid pNZ8048-plnD, with Lactobacillus plantarum ZJQ genome as template, PCR amplification of plnD gene fragment was amplified by the PCR product purification kit and specific amplification bands, purified PCR products and plasmid pNZ8048 by NcoI and Hind saliand III after purification, 16 C connected overnight, the recombinant plasmid pNZ8048-plnD. The recombinant plasmid pNZ8048-PlnD can be expressed in Lactobacillus plantarum ZJ316 (lack of regulatory protein PlnC and PlnD). This system is helpful to study and explore the transcription of PlnC in Lactobacillus plantarum ZJ316 in regulating mechanism, and is helpful to reveal the PlnD of Lactobacillus plantarum ZJ316 bacteriocin synthesis metabolic regulation mechanism, provide a theoretical basis for the study of ZJ316 quorum sensing mode of Lactobacillus plantarum, also provide a new idea for Lactobacillus plantarum ZJ316 high yield of bacteriocin also, has very important significance in the development of bacteriocins of Lactobacillus plantarum ZJ316 and commercial use.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物工程
，具体涉及一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法。
技术介绍
植物乳杆菌广泛存在于人体和动物肠道内、腌制果蔬、腌制肉制品中，能利用葡萄糖发酵代谢生产大量乳酸。除此之外，植物乳杆菌还能在胞外分泌一些具有抗菌活性的细菌素。细菌素能被吸附在指示菌细胞膜上，引起指示菌细胞膜结构改变形成空洞，导致指示菌胞内K+、ATP、氨基酸和磷酸盐等物质外泄而死亡。细菌素具有热稳定、无毒、高效和安全等特点。植物乳杆菌ZJ316是从健康婴儿粪便中分离筛选得到的一株植物乳杆菌，对该菌的上清发酵液过膜除菌，经排酸、过氧化物以及胰蛋白酶和蛋白酶K等酶处理之后进行抑菌试验，试验结果表明经过一系列处理后的发酵上清仍然对指示菌具有较强的抑菌效果，并经过全基因组测序，确认植物乳杆菌ZJ316在发酵过程中产细菌素。相比较乳酸链球菌所产的Nisin细菌素对革兰氏阳性菌呈广谱抑菌而言，植物乳杆菌ZJ316所产的细菌素对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、李斯特、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性和阳性致病菌具有明显的抗菌作用，具有抗菌广谱性。综上所述，植物乳杆菌ZJ316细菌素在食品、工业、农业和医药等领域具有较大的开发价值。植物乳杆菌ZJ316细菌素合成基因簇的5个启动子序列非常相似，具有高度保守的-35和-10区(5’-TACGTTAAT-3’)，-35区和-10区之间间隔着12bp的距离，研究表明这两个区域的间隔长度对转录效果具有很大的影响。通过对植物乳杆菌细菌素生物合成的群体感应调节操纵子plnABCD分析，植物乳杆菌ZJ316存在群体感应调控的信号肽基因基因plnc8IF和组氨酸蛋白激膜蛋白酶基因plnB，但是胞内缺乏调控蛋白基因plnC和plnD，因此，我们猜测三种可能性：一是植物乳杆菌ZJ316胞内缺乏调控蛋白，群体感应信号通路中断；二是除文献已报道的调控蛋白基因plnC和plnD外，还存在类似调控功能的未知蛋白PlnX；三是植物乳杆菌ZJ316还存在另外一套细菌素生物合成群体感应调节机制。本课题针对第一种猜测，通过将克隆有调控基因的重组质粒转化至植物乳杆菌ZJ316胞内，利用载体质粒上的信号肽强转录启动子Pnc8IF表达调控蛋白以弥补群体感应调控蛋白的缺失，搭建完善群体感应调节通路，研究和探讨调控蛋白PlnC和PlnD在植物乳杆菌ZJ316细菌素代谢合成作用调节机制。通过调控蛋白在植物乳杆菌ZJ316胞内表达可以为植物乳杆菌ZJ316细菌素群体感应模式研究提供理论依据；为群体感应系统的开发奠定基础；为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌ZJ316细菌素的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，以便更好的研究调控蛋白PlnD对植物乳杆菌细菌素的生物代谢的调控机制。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，以植物乳杆菌ZJQ基因组为模板，PCR扩增plnD目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经NcoI和HindIII双酶切后纯化，16℃连接过夜，得到重组质粒pNZ8048-plnD。所述PCR扩增所用引物为：上游引物：5'-CATGCCATGGCTTTGTTTCCAATTTATTTATACGA-3'；下游引物：5'-CCCAAGCTTCTAGTTGTCTCTCAACAACTTAT-3'。所述PCR扩增反应体系为：10×buffer(Mg2+)2μL，2.5mmol/LdNTPMixture1.6μL，10μmol/L上游引物0.8μL，10μmol/L下游引物0.8μL，DNA模板1μL，rTaqDNAPolymerase0.2μL，其余为灭菌超纯水，总体积为20μL；所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；进入循环，95℃变性30s，49℃退火50s，72℃延伸50s，31个循环；反应结束后72℃延伸10min，降温至4℃保存。PCR产物的双酶切反应体系为：10×KBuffer4μL，plnDPCR产物30μL，NcoI2μL，HindIII2μL，ddH2O2μL，总体积为40μL；pNZ8048的双酶切反应体系为：10×KBuffer4μL，pNZ8048质粒30μL，NcoI2μL，HindIII2μL，ddH2O2μL，总体积为40μL。所述过夜连接的连接体系为：plnD酶切目的片段6μL，酶切质粒pNZ80482μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNAligase1μL，总体积10μL。植物乳杆菌存在群体感应效应，其中plnABCD是群体感应调控操纵子，plnCD编码调控蛋白PlnC和PlnD。有报道表明，PlnC可能起促进转录作用，PlnD可能起抑制转录作用，但目前关于两者究竟如何调节转录及其作用机制尚不明确。本专利技术构建的重组质粒pNZ8048-PlnC和pNZ8048-PlnD，能在植物乳杆菌ZJ316(缺乏调控蛋白PlnD)中表达。该体系有助于研究和探讨PlnC和PlnD在植物乳杆菌ZJ316中的转录调节机制，进而有助于揭示PlnD对植物乳杆菌ZJ316细菌素合成代谢调节机制，为植物乳杆菌ZJ316群体感应模式研究提供理论依据，也为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌ZJ316细菌素的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。同时，该体系也适用于研究PlnD对除ZJ316外的其他植物乳杆菌细菌素合成调节机制，为植物乳杆菌群体感应系统的开发奠定基础。本专利技术中涉及的植物乳杆菌ZJQ已于2013年03月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，分类命名：植物乳杆菌，拉丁文学名Lactobacillusplantarum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年03月29日，保藏编号7391。附图说明图1植物乳杆菌ZJQ基因组；注：M：Marker，上样量3μL；L1-L2：植物乳杆菌ZJQ基因组，上样量5μL。图2PCR扩增plnC目的基因；注：M：Marker，上样量3μL；L1-L9：植物乳杆菌ZJQ号plnC基因PCR基因电泳条带，上样量3μL；L10：不加D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组质粒pNZ8048‑plnD的构建方法，其特征在于以植物乳杆菌ZJQ基因组为模板，PCR扩增plnD目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经NcoI和Hind III双酶切后纯化，16℃连接过夜，得到重组质粒pNZ8048‑plnD。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于以植物乳杆菌ZJQ基因组为模
板，PCR扩增plnD目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增
条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经NcoI和HindIII双酶切后纯化，16℃连接过夜，
得到重组质粒pNZ8048-plnD。
2.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于：所述PCR扩
增所用引物为：
上游引物：5'-CATGCCATGGCTTTGTTTCCAATTTATTTATACGA-3'；
下游引物：5'-CCCAAGCTTCTAGTTGTCTCTCAACAACTTAT-3'。
3.根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于：所述PCR扩
增反应体系为：10×buffer(Mg2+)2μL，2.5mmol/LdNTPMixture1.6μL，10μmol/L上游
引物0.8μL，10μmol/L下游引物0.8μL，DNA模板1μL，rTaq...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾青，郦萍，王小丰，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33