一种IL-1RA-PEP融合蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种IL-1RA-PEP融合蛋白及其制备方法和用途。该融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。利用基因体外重组技术将细胞渗透肽PEP序列与抗炎分子IL-1RA基因相融合，构建了融合蛋白表达载体，通过诱导表达，发酵和纯化制备了IL-1RA-PEP融合蛋白。将制备的IL-1RA-PEP融合蛋白用缓冲液稀释至一定的浓度，静脉注射，治疗缺血再灌注损伤。本发明专利技术制备的IL-1RA-PEP融合蛋白能显著抑制缺血再灌注继发性炎症反应，减轻组织梗死发生的概率。

IL-1RA-PEP fusion protein and preparation method and application thereof

The invention discloses a IL-1RA-PEP fusion protein, a preparation method and an application thereof. The amino acid sequence of the fusion protein is shown in the sequence list SEQ ID NO1. Using gene recombination technology in vitro cell permeable peptide PEP sequence and anti-inflammatory molecule IL-1RA gene fusion expression vector was constructed by fusion protein, induced expression, fermentation and purification of IL-1RA-PEP fusion protein preparation. The prepared IL-1RA-PEP fusion protein was diluted with buffer to a certain concentration. The IL-1RA-PEP fusion protein prepared by the present invention can significantly inhibit the secondary inflammatory reaction after ischemia reperfusion, and reduce the probability of tissue infarction.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于缺血再灌注
，具体涉及一种IL-1RA-PEP融合蛋白及其制备方法和用途。
技术介绍
缺血再灌注损伤是在缺血性损伤的基础上发展而来的，涉及很多疾病和病理过程。凡是在组织器官缺血基础上的血液再灌注都可能成为发生缺血再灌注损伤的原因。常见的有，休克时微循环障碍的缓解，心、脑、肺复苏后及冠状动脉痉挛的缓解，或是断肢再植术及器官移植术后。缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，目前认为炎症反应是其继发性损伤机理的一部分，伴随其发生发展过程。炎症反应在缺血再灌注损伤发生后几小时开始持续数天，是一种迟发型过程，因此针对炎症的治疗就比其他的保护治疗方法有更长的治疗时间窗，是治疗缺血再灌注损伤的重要靶点。IL-1RA是天然的抗炎分子，研究表明，其对于缺血性脑卒中和急性心肌梗塞等缺血性疾病，均具有一定的治疗作用。但IL-1RA渗透到炎症损伤部位的有效浓度较低，因此限制了IL-1RA的治疗疗效。PEP是一种细胞渗透肽，两性多肽，其可以携带生物大分子渗透细胞膜及一些生物膜结构，使这些大分子可以定位到细胞质，胃肠循环，皮下真皮组织，及脑实质等部位，发挥其生物学效应。IL-1RA和PEP融合蛋白是否可以帮助IL-1RA渗透到一些组织炎症部位，提高IL-1RA发挥作用的有效浓度，目前，还没有详细的研究报告。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种IL-1RA-PEP融合蛋白。本专利技术的目的还在于提供上述融合蛋白的制备方法及用途。一种IL-1RA-PEP融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO1所示。所述IL-1RA-PEP融合蛋白的基因序列如序列表SEQIDNO2所示。一种含上述IL-1RA-PEP融合蛋白的基因载体。含有上述IL-1RA-PEP融合蛋白的基因载体的宿主菌。扩增上述的IL-1RA-PEP融合蛋白基因的任一基因片段的引物。一种IL-1RA-PEP融合蛋白的制备方法，在构建缺失信号肽的IL-1RA基础上，利用基因体外重组技术将细胞渗透肽PEP序列与IL-1RA基因相融合。进而构建融合蛋白高效表达载体，经过发酵和纯化分离技术获得高纯度IL-1RA-PEP融合蛋白。活性实验表明，与IL-1RA比较，IL-1RA-PEP具有更强的拮抗IL-1的效应。所述纯化的IL-1RA-PEP融合蛋白为经过阴、阳离子交换和凝胶过滤层析，3种色谱分离技术纯化制备的蛋白。上述IL-1RA-PEP融合蛋白在制备缺血再灌注损伤的药物方面的应用。所述IL-1RA-PEP融合蛋白用生理盐水稀释至0.1-5mg/ml，制成静脉注射药物，静脉注射，治疗缺血再灌注损伤。所述IL-1RA-PEP融合蛋白大鼠体内注射用量为1-100mg/kg。所述的IL-1RA-PEP融合蛋白对缺血再灌注损伤的保护作用，主要是IL-1RA-PEP通过抑制缺血再灌注诱发的继发性炎症反应，从而达到这种保护作用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术制备了具有抗炎和透膜功能的IL-1RA-PEP融合蛋白，同时利用PEP具有携带大分子渗透生物膜结构的功能，提高抗炎分子IL-1RA渗透缺血再灌注损伤大鼠组织的效率，提高IL-1RA到达组织炎症部位有效浓度，有效地发挥了抑制缺血再灌注损伤继发性炎症反应的作用。附图说明图1为双酶切鉴定构建的PBV/IL-1RA-PEP重组表达载体电泳图。图2为纯化制备的IL-1RA-PEP融合蛋白鉴定图。图3为制备的IL-1RA-PEP融合蛋白拮抗IL-1生物学活性。图4为IL-1RA-PEP融合蛋白对缺血再灌注大鼠脑组织的渗透效率；其中，A:静脉注射的IL-1RA渗透到缺血再灌注脑组织大脑皮层部位；B:静脉注射的IL-1RA渗透到缺血再灌注脑组织大脑纹状体部位；C：静脉注射的IL-1RA-PEP渗透到缺血再灌注脑组织大脑皮层部位；D:静脉注射的IL-1RA-PEP渗透到缺血再灌注脑组织纹状体部位。图5为IL-1RA-PEP融合蛋白对缺血再灌注大鼠脑组织中炎性因子含量，炎性细胞活化和浸润的抑制作用；其中，A:缺血再灌注脑组织中IL-6含量变化；B:缺血再灌注脑组织中TNF-α含量变化；C：缺血再灌注脑组织中中性粒细胞活化数量变化；D:缺血再灌注脑组织中巨噬细胞浸润程度变化。图6为IL-1RA-PEP融合蛋白减轻缺血再灌注大鼠脑梗死比较图；其中，A:正常大鼠脑组织；B:模型组大鼠脑组织；C：IL-1RA-PEP治疗组大鼠脑组织。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。由于脑缺血损伤在全身组织缺血损伤中，相同时间所造成的损伤更为严重，同时，静脉注射IL-1RA在脑中的药物浓度最低，因此，利用脑缺血损伤再灌注模型研究全身组织缺血再灌注损伤具有代表性，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版[1]相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。实施例1IL-1RA-PEP融合基因的构建根据GenBank中IL-1RA基因序列及PBV220表达载体多克隆酶切位点，设计引物，上游引入EcoRⅠ酶切位点，下游引入BamHⅠ酶切位点。重叠PCR方法扩增IL-1RA-PEP融合基因。将融合基因与表达载体分别经双酶切和连接反应，并转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，筛选阳性单克隆，最后经双酶切和测序鉴定构建的重组表达质粒PBV220/IL-1RA-PEP(如图1所示)。实施例2IL-1RA-PEP融合蛋白的表达和纯化将含有重组表达质粒的工程菌，42℃诱导表达，通过40L发酵罐进行发酵培养，获得含有IL-1RA-PEP目的蛋白的菌体。利用阴、阳离子交换层析(HitrapQFF，HitrapSPFF)和凝胶过滤(SephacrylS200)层析纯化目的蛋白IL-1RA-PEP(如图2所示)。实施例3活性分析设置IL-1RA-PEP融合蛋白4个浓度梯度1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml，检测其抑制50pg/mlIL-1α(R&Dsystems,USA)刺激EL4产生IL-2的量，并以IL-1RA(R&Dsystems,USA)为对照，37℃，5％CO2培养细胞24h，每个样品均设3个复孔。比较不同浓度下IL-1RA-PEP和IL-1RA拮抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种IL‑1RA‑PEP融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。

【技术特征摘要】
1.一种IL-1RA-PEP融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序
列如序列表SEQIDNO1所示。
2.根据权利要求1所述的IL-1RA-PEP融合蛋白，其特征在于，所述
IL-1RA-PEP融合蛋白的基因序列如序列表SEQIDNO2所示。
3.一种含权利要求1所述IL-1RA-PEP融合蛋白的基因载体。
4.含有权利要求3所述IL-1RA-PEP融合蛋白的基因载体的宿主菌。
5.扩增权利要求2所述的IL-1RA-PEP融合蛋白基因的任一基因片段的
引物。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐东刚，张冬冬，邹民吉，付文亮，徐涛，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11