一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检测方法：利用膜过滤装置分离获取晚期结直肠癌患者外周血中的CTC；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而检测结直肠癌患者VEGF基因表达情况。通过该技术方法，不用结直肠癌组织即可检测到无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者VEGF的表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。

Method for detecting circulating tumor cell VEGF in peripheral blood of patients with advanced colorectal cancer

The invention discloses a method for detecting patients with advanced colorectal cancer circulating tumor cells in peripheral blood of VEGF: by using membrane filtration and separation device for patients with advanced colorectal cancer in peripheral blood CTC cells; using wax technology to produce thin slices; and to detect the expression of VEGF gene in colorectal cancer. By using this method, the expression of VEGF in colorectal cancer patients with advanced colorectal cancer tissues could not be detected without colorectal cancer tissues. The technique is minimally invasive and can be detected in real time.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测VEGF的新方法，尤其是晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的方法。
技术介绍
对于晚期结直肠癌患者，靶向联合化疗可以明显延长晚期结直肠癌无病无进展生存期和总生存期。晚期结直肠癌患者临床目前应用的靶向药物中血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)受体抑制剂贝伐单抗(Bevacizumab)在临床实践中取得了显著的疗效。VEGF是一种正常细胞和肿瘤细胞都可产生的同型二聚体糖蛋白，并且在血管生成过程中发挥重要作用。VEGF表达水平在肿瘤组织明显高于非肿瘤组织。VEGF是迄今所发现的最重要的促血管生成因子，它可通过血管内皮上的受体(VEGFR)介导的受体信号转导通路，促进血管内皮细胞增殖、迁移，阻止血管内皮细胞凋亡和管腔网状结构退化，增加血管渗透性。人的VEGF基因由8个外显子和7个内含子构成，其mRNA通过不同的剪切方式，编码为不同的VEGF亚型，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-D和VEGF-E，其中VEGF-A缺失外显子6，而VEGF-B缺失外显子6和7。研究发现人体组织和肿瘤中主要以VEGF-A和VEGF-B为主。VEGF受体(VEGFR)为酪氨酸激酶受体，分为VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3，除此之外，VEGF还有两个辅助受体，分别为Neuropilin-1(NRP1)和Neuropilin-2(NRP2)。不同VEGF可以与其不同受体相互作用。VEGF-A是血管形成因子家族中最重要的成员，其作用于跨膜的酪氨酸激酶受体VEGFR-1和VEGFR-2。与配体结合后，受体产生二聚作用并引起胞质激酶的自身磷酸化，对下游信号分子产生作用。在正常的内皮组织中，VEGFR的表达较低；而在肿瘤组织中其表达水平明显升高。肿瘤新生血管为营养物及氧气进入肿瘤组织，将代谢产物运出组织细胞外，并为肿瘤的转移提供了基本条件。VEGF-A主要通过激活在肿瘤血管中过度表达的VEGFR-2起作用。由于VEGF-A在肿瘤发生过程中的重要地位，目前已成为抗血管生成治疗的靶点。目前VEGF检测的主要为免疫组织化学方法，通过检测结直肠癌组织标本中的VEGF蛋白表达情况判定VEGF状态。该方法应用广泛，但目前主要应用于组织标本的染色检查。而对于晚期无法获取组织标本的结直肠癌患者，VEGF的表达状态评估变得困难。
技术实现思路
循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell，CTC)是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。目前临床对于不能获取临床病理标本的晚期结直肠癌患者治疗仍为经验性用药，而不能进行针对性的靶向治疗。为了克服晚期结直肠癌患者不适宜组织标本取材，进而无法评估患者VEGF表达状态的不足，本专利技术提供了一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检测方法：利用膜过滤装置分离获取晚期结直肠癌患者外周血中的CTC；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而检测结直肠癌患者VEGF基因表达情况。本专利技术采用的技术方案如下：一、利用膜过滤装置分离获取晚期结直肠癌患者外周血中的CTC：1、采集晚期结直肠癌患者外周血：肘正中静脉血5ml；2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；4、过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，纯水1ml，冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：1、脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按容积比1:1混匀。2、包裹：浸泡结束后取出滤膜，用显微镜擦镜纸或滤纸包裹；3、固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；4、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；5、薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片。三、检测晚期结直肠癌患者外周血CTC的VEGF表达情况：1、将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟；95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PBS(PH＝7.4)浸泡3次，每次3分钟；2、采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复：取pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，喷汽1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS冲洗两次，每次各5分钟；3、3％H2O2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次3分钟；4、滴加VEGF一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3次，每次5分钟；5、滴加通用型生物素化二抗，室温或37℃孵育60分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；6、应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5-10分钟；7、蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水溶液返蓝；50％、70％、85％、95％无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；8、细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定VEGF表达情况。步骤中所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检测方法，其特征在于，所述的方法为：利用膜过滤装置分离获取晚期结直肠癌患者外周血中的CTC；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而检测结直肠癌患者VEGF基因表达情况。

【技术特征摘要】
1.一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检测方法，其特征在
于，所述的方法为：利用膜过滤装置分离获取晚期结直肠癌患者外周血中
的CTC；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而检测结直肠癌患者VEGF基
因表达情况。
2.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检
测方法，其特征在于，所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、
废液缸(5)和铁架台(1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12)
和支架(13)，所述血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上
部，血样容器(2)的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通
至废液缸(5)，废液缸(5)设置于底座(11)上。
3.根据权利要求2所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检
测方法，其特征在于：所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载
滤膜平台(8)和滤器下口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台8上；滤器上
口(6)接血样容器(2)，滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。
4.根据权利要求3所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检
测方法，其特征在于：所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口
径为10微米的滤孔(10)。
5.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检
测方法，其特征在于，所述的利用膜过滤装置分离获取晚期结直肠癌患者
外周血中的CTC，其方法步骤如下：
1)采集晚期结直肠癌患者外周血：肘正中静脉血5ml；
2)外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：
1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定
终浓度为0.25％；
3)利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环
肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容
器(2)中，使其依靠重力自然过滤；
4)过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器(3)，将循
环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器(3)中，染色3min，PBS缓冲液
冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，纯水1ml，冲洗2
次取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。
6.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检
测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王爱亮，薛雁，李胜，王振丹，
申请(专利权)人：山东省肿瘤防治研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37