基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，通过环氧氯丙烷活化琼脂糖微球与葡聚糖聚合，在不降低琼脂糖微球表面羟基数目的情况下，增加了琼脂糖微球的表面积，同时葡聚糖分子有效的降低了琼脂糖微球的电荷效应，再次将活化的琼脂糖微球连接L-天门冬氨酸并通过溴乙酸处理，生成具有较长延长臂，保证镍金属能够与重组蛋白高效结合，提高介质的纯化效果。该发明专利技术解决了现有琼脂糖微球中交联步骤繁琐，交联后介质偶联配基密度较低以及琼脂糖理化性质影响纯化效果的问题。

Preparation method of nickel metal chromatography medium based on 6B agarose microspheres and application thereof

The present invention provides a method for preparing nickel Sepharose 6B chromatography media based by epichlorohydrin activated Sepharose and Sephadex polymerization, without reducing the surface hydroxyl number of agarose beads under the condition of increasing the surface area of agarose beads, with dextran molecules effectively reduces the charge effect of agarose microspheres again, the activated agarose beads connected L- aspartic acid and acetic acid by bromine, generation has a longer extension arm, to ensure efficient nickel metal combined with recombinant protein, improve the purification effect of medium. The invention solves the problems that the crosslinking steps of the prior agarose microspheres are complicated, the density of the coupling medium is low and the physical and chemical properties of agarose affect the purification effect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质纯化
，具体涉及一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用。
技术介绍
现代生物医药产业的高速发展，要求生物材料的性能逐步提高。以琼脂糖制备的亲和层析介质广泛运用于蛋白质的分离工程中，介质性能直接决定了分离纯化的效率。琼脂糖作为一种富含有羟基，具有良好的生物可溶性，是分离纯化过程中，运用最广泛的基质合成材料。但是，由于普通的琼脂糖微球硬度较低，在高压的条件下容易产生形变，减低微球间空隙的大小，直接导致纯化介质的流速降低；而一味的提高流速会直接导致琼脂糖微球的破裂，影响纯化效果。基于此种局限性，通常会对琼脂糖微球进行交联和改性。现有报道中，常见的交联剂为含有环氧、Cl和Br等活性较高官能团的有机物。较早的报道如PorathJC(1975,journalofchromatography10349-62)等利用碱性条件下，环氧氯丙烷与琼脂糖微球进行反应，制备拥有一定机械强度的微球。PernemalmP等在专利EP0203049A1中报道，通过一种分步交联的方法，实现琼脂糖微球的高度交联，即利用含有多个环氧官能团的有机物如1,4-丁二醇缩水甘油醚、三环氧丙基异氰尿酸酯等，利用这些有机物较长的分子链，先对琼脂糖的空间结构进行稳定，而后利用环氧氯丙烷对琼脂糖微球的结构进行加强，获得拥有较高强度的微球。与此同时，为了获得较高纯度的目标蛋白，减少分离步骤、降低生产成本，需要利用特殊手段对琼脂糖进行改性。镍金属亲和层析就是利用含有六个组氨酸标签的重组蛋白，能够特异性结合于金属镍上。正是利用这一特性，我们能够制备出含有镍的亲和纯化介质。PorathJ等在1975年首次报道了利用金属离子能够与蛋白之间发生亲和作用，并成功的利用这一特性实现了对目标蛋白的分离和纯化。然而，由于天然琼脂糖中含有大量的含硫的物质，且难以处理干净。使得纯化过程中纯化介质带有电荷效应，对样品中的杂蛋白产生吸附作用，影响洗脱效果。因此，需要克服琼脂糖微球的电荷效应这种理化性质，提高蛋白质纯化效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有琼脂糖微球中交联步骤繁琐，交联后介质偶联配基密度较低以及琼脂糖理化性质影响纯化效果的问题。为此，本专利技术提供了一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.5～0.9:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时制得活化的琼脂糖微球。2)将1M的氢氧化钠、0.1～0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.3～0.9:1:1混合，在反应温度为25～37℃的条件下，反应5～10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球。3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.4～0.8:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1或1:2混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.1M～0.3M，在50～60℃下反应5～10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性。6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1或1.5:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.3M～0.6M，在25～30℃下反应5～12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性。7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应2～3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。上述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。上述步骤2)中的葡聚糖分子量为4000。本专利技术中，优选的一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，包括如下步骤：1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.2:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时制得活化的琼脂糖微球。2)将1M的氢氧化钠、0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.8:1:1混合，在反应温度为25℃的条件下，反应10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球。3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.4:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.3M，在60℃下反应10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性。6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.6M，在25～30℃下反应12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性。7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。另外，本专利技术还提供了采用该方法制得的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质在纯化蛋白中的应用，具体过程为：将上述制得的镍金属层析介质与含有重组蛋白的菌株破碎后的上清液混合进行亲合吸附，然后利用不同咪唑浓度的PBS溶液对镍金属层析介质进行洗脱，收集每个浓度的洗脱液。进一步地，所述PBS溶液的咪唑浓度为25mM和150mM。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术提供的这种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法通过环氧氯丙烷活化琼脂糖微球与葡聚糖聚合，在不降低琼脂糖微球表面羟基数目的情况下，增加了琼脂糖微球的表面积，使得微球具有更高的硬度，同时葡聚糖分子有效的降低了琼脂糖微球的电荷效应，提高了纯化介质的流速。(2)本专利技术提供的这种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法将活化的琼脂糖微球连接L-天门冬氨酸并通过溴乙酸处理，生成具有较长延长臂，能够保证镍金属能够与重组蛋白高效结合，提高介质的纯化效果。(3)采用本专利技术制备方法制备的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质可用于重组蛋白的洗脱，洗脱效果好。以下将结合附图对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1是本专利技术中重组蛋白EGFP洗脱峰图。图2是本专利技术中重组蛋白EGF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.5～0.9:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时制得活化的琼脂糖微球；2)将1M的氢氧化钠、0.1～0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.3～0.9:1:1混合，在反应温度为25～37℃的条件下，反应5～10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.4～0.8:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1或1:2混合后，加入L‑天门冬氨酸至终浓度为0.1M～0.3M，在50～60℃下反应5～10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性；6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1或1.5:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.3M～0.6M，在25～30℃下反应5～12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性；7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应2～3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。...

【技术特征摘要】
1.一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.5～0.9:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时制得活化的琼脂糖微球；
2)将1M的氢氧化钠、0.1～0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.3～0.9:1:1混合，在反应温度为25～37℃的条件下，反应5～10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；
3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.4～0.8:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；
4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；
5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1或1:2混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.1M～0.3M，在50～60℃下反应5～10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性；
6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1或1.5:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.3M～0.6M，在25～30℃下反应5～12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性；
7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应2～3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。
2.如权利要求1所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。
3.如权利要求1所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的葡聚糖分子量为4000。
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【专利技术属性】
技术研发人员：董垚，郑忠亮，夏其林，
申请(专利权)人：武汉菲恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42