一种成纤维细胞诱导分化为多功能干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，具体涉及的是一种白癜风病人皮损处成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，属于生物技术领域；本发明专利技术通过采用四因子导入法将白癜风病人皮损处成纤维细胞诱导为多功能干细胞，对诱导出来的细胞进行鉴定，确定其具有干细胞的特性，与ES细胞相似；ES细胞来源具有伦理学争议，利用病人体细胞诱导出的多功能干细胞来源广泛、没有免疫排斥反应，并且具有相应疾病特征，可以进行疾病研究、药物筛选等；多种病人的体细胞可以诱导出多功能干细胞，本发明专利技术首次用白癜风病人皮损处成纤维细胞诱导出多功能干细胞。

Method for inducing differentiation of fibroblasts into multifunctional stem cells

The invention relates to a fibroblast induced pluripotent stem cells, in particular to a vitiligo patients the lesions of fibroblast induced pluripotent stem cells, which belongs to the field of biotechnology; the invention adopts four factor into method of vitiligo patients lesional fibroblast induced by multi function stem cells, identification of induced cells, determine its have the characteristics of stem cells, similar to ES cells; ES cells with ethical controversy, the function of human cells induced disease derived from stem cells widely, no immune rejection, and has the corresponding disease characteristics, for disease research, drug screening many patients; somatic cells can induce pluripotent stem cells, with the invention of vitiligo patients the lesions of fibroblasts induced by many for the first time Functional stem cell.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种成纤维细胞诱导分化为多功能干细胞的方法，具体涉及的是一种白癜风病人皮损处皮肤成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，属于生物

技术介绍
白癜风(vitiligo)是一种常见的局部或全身色素脱失性皮肤病，该病发病率约为0.5-2%，临床表现为色素脱失，及白斑形成，边缘较清晰。白癜风的发病机制不是很明确，近年来研究与遗传因素、自身免疫因素、氧化应激反应、黑素细胞自身破坏以及精神神经因素等方面有关。该病治疗方法有多种，包括药物治疗、物理治疗、外科手术治疗等，但效果并不十分理想，对患者的生活造成一定影响。用干细胞进行疾病治疗的研究近年来已有许多成果，对于白癜风的治疗也可以利用干细胞来实现。由于白癜风病人皮损处的黑素细胞功能下降甚至缺失，可以利用干细胞诱导出黑素细胞后进行相关治疗。目前诱导分化出黑素细胞的干细胞有胚胎干细胞（EScell）、缪斯细胞（Musecell）、间充质干细胞（MSC）、诱导多功能干细胞（iPScell）。诱导多功能干细胞首先是由日本科学家Yamanaka利用小鼠成纤维细胞诱导出来的（Takahashi,K.andS.Yamanaka,Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell,2006.126(4):p.663-76.），通过过表达Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子使细胞从终末分化状态变为干细胞状态。后来又成功利用人成纤维细胞实现了向干细胞的诱导。iPS细胞在形态、表观遗传、功能等方面与ES细胞相似，但却避免了ES细胞所要面临的伦理学问题。自从iPS技术问世后，其成为一个全球的研究热点。全世界许多实验室都在逐步利用不同病人来源的体细胞重编程出相应的iPS细胞，这类细胞不仅具有相应疾病的特征性改变，并且对疾病模型的建立、研究以及药物筛选等方面具有重要意义。目前已经成功建立iPS细胞系的疾病包括高雪氏症、帕金森病、21三体综合征（Park,I.H.,etal.,Disease-specificinducedpluripotentstemcells.Cell,2008.134(5):p.877-86.）、扩张型心肌病（Sun,N.,etal.,Patient-specificinducedpluripotentstemcellsasamodelforfamilialdilatedcardiomyopathy.SciTranslMed,2012.4(130):p.130ra47.）、色素性视网膜炎（Jin,Z.B.,etal.,ModelingRetinalDegenerationUsingPatient-SpecificInducedPluripotentStemCells.PlosOne,2011.6(2).）、多发性神经纤维瘤（Larribere,L.,etal.,NF1lossinducessenescenceduringhumanmelanocytedifferentiationinaniPSC-basedmodel.PigmentCellMelanomaRes,2015.）、白血病（Kurokawa,M.andM.Miyauchi,[Inducedpluripotentstemcellsfromleukemiapatientsasaplatformfordissectingpathogenesis].RinshoKetsueki,2014.55(10):p.2202-7.）、类风湿性关节炎（Lee,J.,etal.,Generationofdisease-specificinducedpluripotentstemcellsfrompatientswithrheumatoidarthritisandosteoarthritis.ArthritisResearch&Therapy,2014.16(1).）等，在皮肤病相关疾病中利用病人体细胞重编程出病人iPS细胞的实例较少。由于iPS细胞可以来源于多种成体细胞，病人的iPS细胞成为一个研究热点。利用病人的成体细胞诱导出的iPS细胞具有此类疾病的特点，所以病人iPS细胞在疾病治疗、疾病模型建立以及药物筛选等方面具有重要的意义。通过基因修饰等手段使病人iPS细胞不具有疾病特征，从而诱导分化出相关的细胞、组织或者器官，进行病人自体移植治疗，不会发生免疫排斥反应，这是iPS细胞与ES细胞相比较的另一个优势。目前已有多种病人的体细胞呗诱导为多功能细胞，而利用白癜风病人的体细胞诱导为多功能干细胞未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种白癜风病人皮损处成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法。本专利技术首次提供用白癜风病人皮损处成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：白癜风病人皮损处成纤维细胞的获取；白癜风病人多功能干细胞的诱导；获得的白癜风病人诱导多功能干细胞的鉴定。（1）白癜风病人皮损处成纤维细胞的获取：A.取得白癜风病人皮损组织后，在超净台取出，用含1%双抗（青霉素和链霉素）PBS缓冲液洗涤3次，剪碎成1mm3小块。B.灭菌后的盖玻片盖于组织块上，加含10%血清的高糖DMEM培养基（Hyclone）37度培养，10至15天可见成纤维细胞出现，2至3天换液。（2）白癜风病人多功能干细胞的诱导：A.步骤（1）所得的白癜风病人皮损处成纤维细胞取105细胞量，再加入Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种逆转录病毒感染，病毒量分别为400μL,过表达Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子。B.细胞培养24h后转移到饲养层细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）上，更换诱导培养基，培养条件为37℃、5%CO2、5%O2，每天换液，显微镜观察细胞形态拍照，12天后挑单克隆至新的饲养层细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）上。其中诱导培养基成分为ES培养基加维生素C（50mg/ml），ES培养基包括80%DMEM/F12、20%KSR、1%Non-essentialaminoacids、1mML-glutaMAX、0.1mMβ-mercaptoethanol、5ng/mlbFGF。C.用ES培养基培养，置于低氧培养箱内，条件为37℃、5%CO2、5%O2，每天更换培养基，显微镜观察细胞形态并拍照。(3)鉴定白癜风病人诱导多功能干细胞的特征，确定其具有干细胞的特点以及功能。本专利技术的技术优点(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，其特征在于，所述的多功能干细胞来源于（1）白癜风病人皮损处成纤维细胞，具体方法包括如下步骤：（2）白癜风病人皮损处成纤维细胞的获取；（3）白癜风病人多功能干细胞的诱导；（4）获得的白癜风病人诱导多功能干细胞的鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，其特征在于，所述的多功能干细胞来
源于（1）白癜风病人皮损处成纤维细胞，具体方法包括如下步骤：
（2）白癜风病人皮损处成纤维细胞的获取；
（3）白癜风病人多功能干细胞的诱导；
（4）获得的白癜风病人诱导多功能干细胞的鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，其特征在于，
步骤（1）所述的白癜风病人皮损处成纤维细胞的获取具体步骤包括：
A．取得白癜风病人皮损组织后，在超净台取出，用含1%双抗的PBS缓冲液洗涤后剪碎成
小块；
B．灭菌后的盖玻片盖于组织块上，加培养基培养，10至15天可见成纤维细胞出现，2至3
天换液。
3.根据权利要求2所述的一种成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，其特征在于，
步骤B中所述培养基为含10%血清的高糖DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的一种成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，其特征在于，步
骤（2）所述的白癜风病人多功能干细胞的诱导具体步骤包括：
A.在步骤（1）中获得的白癜风病人皮损处成纤维细胞中加入逆转录病毒感染，过表达
逆转录病毒；
B.细胞培养24h后转移到饲养层细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：李遇梅，李淑，刘莉萍，许辉，惠利健，郑允文，
申请(专利权)人：江苏大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32