腈水解酶突变体、基因、载体、工程菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种腈水解酶突变体、基因、载体、工程菌及制备R-扁桃酸的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第190位丝氨酸进行定点突变获得的；本发明专利技术所述的腈水解酶突变体(氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示)较亲本腈水解酶(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)比酶活提高3.0倍，对映体选择性从94％提高到大于99％。结果表明，腈水解酶突变体(氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示)能够用少量湿菌体(10g/L)在30min内完全水解100mM扁桃腈，对映体选择性大于99％。可用于工业化生产医药中间体R-扁桃酸。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种腈水解酶，特别涉及一种利用基因突变获得的腈水解酶突变体及其在制备医药中间体(R)-扁桃酸中的应用。(二)
技术介绍
腈水解酶(EC3.5.5.1)：腈水解酶超级家族中一类重要的工业用酶，含有一个特定的空间结构，蛋白结构单元由一个α-β-β-α的三明治结构组成，腈水解酶的这种结构已经通过X-ray衍射技术得到确认。根据蠕虫NiFhit晶体结构分析，其活性部位含有Glu-Lys-Cys3个残基，Brenner小组推测整个腈水解酶大家族可能是通过Glu-Lys-Cys3个残基来催化的。腈水解酶的反应机理如图1所示，腈水解酶先攻击CN共价键，形成酶与底物共价结合的中间体，继而加上一分子的水，并放出一分子的氨，当加上第二分子的水时，生成酸和酶。腈水解酶的半胱氨酸残基上的巯基具有很强的亲核性，使整个过程类似于一般化学反应中碱催化下的氰基水解。腈水解酶的主要功能在于水解腈类化合物生成相应的羧酸。按照催化底物的不同，可以将腈水解酶分为三大类，即脂肪腈水解酶(aliphaticnitrilase)、芳香腈水解酶(aromaticnitrilase,主要水解芳香腈、杂环腈)和芳基脂肪腈水解酶(arylaliphaticnitrilase)。利用腈水解酶的催化活性是降解环境污染中高毒性腈的有效途径。故腈水解酶不但能应用于环境污染问题，而且能生产重要的医药中间体。在自然界中，腈水解酶来源广泛，主要有细菌，丝状真菌，酵母，植物等，并以细菌为主要来源。从生物技术应用角度，微生物腈水解酶作为绿色催化剂更具有商业价值。扁桃酸(mandelicacid)又称作苦杏仁酸、苯乙醇酸或α-羟基苯乙酸。其中光学纯(R)-扁桃酸(式Ⅰ)是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体，广泛应用于多种光学活性药物的合成，如头孢菌素和半合成青霉素等抗生素、抗肿瘤药物、减肥药物、农药及其他药物。(R)-扁桃酸还是重要的手性拆分剂和手性催化剂，而且还能用于测定手性物质的绝对构型及光学纯度等。(R)-扁桃酸被称为“万能”拆分剂，其对醇胺类药物的拆分效果优秀，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物，并且以(R)-扁桃酸为催化剂可将芳香族及脂肪族醛均不对称转化成为相应手性醇。据统计，国际上已有部分公司有能力合成光学纯(R)-扁桃酸，主要有日东化学公司、日本山川药品公司以及德国瓦克公司等。目前，国内也已经有部分企业能够生产光学纯的扁桃酸，但还没有出现规模化生产单一构型的报道。因此，加大力度对单一构型扁桃酸的研究开发，打破国外企业对手性(R)-扁桃酸的市场垄断，并寻找适合我国工业化生产的方法意义重大。与此同时，研究出新的生产工艺用于(R)-扁桃酸和其他手性药物的工业生产，不仅对满足我国光学活性药物产品市场的需要具有实际意义，而且对解决手性
所存在的多种问题也具有重大的理论指导意义。(Ⅰ)(R)-扁桃酸由于生物酶对底物有高度的立体选择性，具有严格的区域选择性和对映体选择性，可直接将化学合成的外消旋衍生物、潜手性化合物或前体转化成单一对映异构体的光学活性产物。生物催化的手性反应还具有效率高、反应条件温和、反应步骤少、产品光学纯度高等优点，并且生物催化过程能耗低、无毒、无污染，符合21世纪“绿色化学”的要求，被认为是手性药物生产取得突破的关键技术。腈水解酶是一类可以将腈转化成相应酸的酶，当以扁桃腈为底物时，腈水解酶将其不对称水解成(R)-扁桃酸，并且它的理论动力学反应产物收率是100％，生产合成路线如图2。Yamamoto等人报道来源于AlcaligenesfaecalisATCC8750的扁桃腈水解酶(Appl.Environ.Microbiol1991,57:3028-3032)能够催化外消旋扁桃腈的动态动力学水解拆分得到扁桃酸，得率为91％，对映体过量值为100％。Rossi等对来源于AlcaligenesfaecalisATCC8750进行了固定化和修饰，固定化后的腈水解酶能高度选择性水解扁桃腈成(R)-扁桃酸，pH为8.5时，收率为99％，产物ee值为99％(Journalofagriculturalandfoodchemistry.2004,52(26):8155-8162)。Rustler等人报道了来源于PseudomonasfluorescensEBC191的重组菌在pH为5时，能够水解扁桃腈，并且保持高的对映体选择性(EnzymeMicrobTech40(2007)598-606)。Kiziak等人将来源于PseudomonasfluorescenEBC191的腈水解酶基因克隆到表达载体pJOE2775中，并在大肠杆菌中表达。重组腈水解酶用于水解扁桃腈生成(R)-扁桃酸，但ee值仅有31％，且有19％的副产物酰胺生成(Microbiology-Sgm.2005,151:3639-3648)。Wang等人报道基于系统发育的酶与底物特异性预测，从BurkholderiacenocepaciaJ2315中筛选得到一株新的腈水解酶BCJ2315(BMC.Biotechnology13(2013)13-14)，其水解扁桃腈生产(R)-扁桃酸的对映体选择性有98.7％，无副产物。重组EscherichiacoliM15/BCJ2315湿菌体(10mg/ml)能够在1h内完全水解100mM扁桃腈。虽然目前在利用腈水解酶催化生产(R)-扁桃酸方面已有一定的进展，但是，发现的腈水解酶在工业生产中仍然存在着许多问题如高浓度的底物抑制，许多反应参数需要进一步改进。所以行业仍需要具有更高活性，更严格对映选择性，更宽特异性或更好稳定性的新腈水解酶，以降低生产工业生产成本。新酶的发现主要是基因组挖掘和宏基因组方法。蛋白质工程的目的是改变对底物特异性，酶活性以及立体选择性。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是通过定点突变的方法对腈水解酶基因进行改造，改造后的腈水解酶工程菌在催化外消旋扁桃腈的酶活性以及立体选择性方面都有提高，使其符合工业化生产(R)-扁桃酸的应用需求。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第190位丝氨酸进行定点突变获得的，优选将第190位丝氨酸突变为甘氨酸(Ser190Gly，核苷酸序列为SEQIDNO.11所示，氨基酸序列为SEQIDNO.12所示)或精氨酸(Ser190Arg，核苷酸序列为SEQIDNO.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第190位丝氨酸进行单点突变获得的。

【技术特征摘要】
1.一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO.2所示
氨基酸序列的第190位丝氨酸进行单点突变获得的。
2.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将第
190位丝氨酸突变为甘氨酸或精氨酸。
3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。
4.一种由权利要求3所述编码基因构建的重组载体。
5.一种由权利要求4所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
6.一种权利要求1-2之一所述腈水解酶突变体在催化扁桃腈制备(R)-扁
桃酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含腈水解酶
突变体编码基因的重组工程菌经诱导培养后离心获得的湿菌体用pH7.5、
0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮制成的菌悬液为酶源，以外消旋扁桃腈为底
物，以pH4.0-9.0的pH缓冲液为反应介质构成反应体系，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，郑裕国，焦标，华登恩，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33