一种检测黄曲霉毒素M1的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素M1的方法及试剂盒。将黄曲霉毒素M1核酸适体(Apt)与单链信号探针DNA(ssDNA)杂交，形成杂交链Apt-ssCNA；将杂交链Apt-ssCNA置于待测样品中，当其中有AFM1存在时，杂交链Apt-ssCNA中Apt段与AFM1反应生成Apt-AFM1复合物，并释放出单链信号探针ssDNA；杂交链Apt-ssCNA经DNA扩增生成双链DNA，在核酸外切酶选择性地催化作用下双链DNA快速水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA不水解而被保留下来；在ssDNA诱导下，银离子还原生成近红外荧光银纳米簇；检测体系荧光强度，依据荧光强度与AFM1量的关系，测定待测样品中AFM1的含量。该方法灵敏度高、操作简单、低成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米生物传感以及生物检测
，具体涉及一种检测黄曲霉毒素M1的方法及试剂盒。
技术介绍
1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，对人畜危害极大。黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。黄曲霉毒素广泛存在于土壤、大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶及其制品、食用油、肉类(鱼)制品、花生和核桃等动植物和各种坚果中，特别是花生和核桃中。由于黄曲霉毒素污染源极广，因此无法完全消除黄曲霉毒素污染。哺乳动物摄入被黄曲霉毒素污染的饲料或食品后，在体内可被羟化而生成黄曲霉毒素M1。奶牛吃了被黄曲霉毒素污染的饲料，所产奶中就会有黄曲霉毒素M1，人们每天都会食用的牛奶，如果其中的黄曲霉毒素M1含量过高，就会造成对人体健康的危害。由于黄曲霉毒素M1具有强的致癌作用，世界卫生组织制定食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg，美国联邦政府有关法律规定人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的含量不能超过300μg/kg。我国《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》发布的国家标准中规定食品中黄曲霉毒素M1在乳及乳制品中的限量为0.5μg/kg。欧盟国家规定原奶、热处理奶及加工奶产品中黄曲霉毒素M1限量为0.05μg/kg，婴儿食品(包括婴幼儿奶)中黄曲霉毒素M1限量为0.025μg/kg。因此，建立高选择性、高灵敏的黄曲霉毒素M1的检测方法具有重要意义。目前国内外研究主要有色谱法、化学发光法和酶联免疫法等。色谱法对操作技术要求高，检测成本较高，免疫法需要使用价格较昂贵的酶、抗体等生化试剂，而且这些生化试剂很容易失活等不足。文献MaterialsScienceandEngineeringC33(2013)2229–2234公布了一种基于黄曲霉毒素M1核酸适体的黄曲霉毒素M1电化学测定法，该法选择性和检测灵敏度均高，只是电极组装较为复杂，需专业人才才能完成。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种简单、快速、灵敏、高选择性的检测黄曲霉毒素M1的方法，该方法包括如下步骤：(1)先分别将含黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液和含单链信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液置于90℃水浴中加热5分钟后，迅速置于冰浴中保持5分钟；分别取上述处理过的3.0μmol黄曲霉毒素M1核酸适体Apt溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA溶液40μL混合，在37℃反应1h，形成杂交链Apt-ssDNA；(2)向该杂交链Apt-ssDNA体系中加入待测样品，当待测样品中有黄曲霉毒素M1即AFM1时，Apt-ssDNA中的Apt选择性地与AFM1反应生成Apt-AFM1，同时释放出单链信号探针ssDNA；(3)剩余Apt-ssDNA的去除：向步骤(2)体系中依次加入10μL扩增缓冲溶液、18μLdNTP(10mM)和2μLPhi29DNA聚合酶(10u/μl)，在37℃下反应8分钟；体系中剩余的Apt-ssDNA经DNA扩增形成双链DNA；接着再向该反应体系中加入2μLExoIII核酸外切酶(20u/μL)和10μLNH4F(25mM)-NaCl(0.1M)溶液，双链DNA在核酸外切酶选择性地催化作用下迅速水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA被保留下来，从而消除剩余杂交链Apt-ssDNA的干扰；其中，所述扩增缓冲溶液组成为50mMTris-HCl，10mMMgCl2，10mM(NH4)2SO4，pH7.5；(4)利用Apt-AFM1不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能够诱导银离子还原生成强荧光的近红外银纳米簇的原理，检测银离子还原检测体系近红外荧光的强度，依据荧光强度与AFM1的量的关系，测定待测样品中的黄曲霉毒素M1即AFM1的含量；其中，所述银离子还原检测体系包括先后添加的150μL柠檬酸钠溶液(10mM，pH8)、10μL银离子溶液(2.5mmol)和使银离子迅速还原成近红外荧光银纳米簇的120μL+4价硫无机化合物还原剂(1mM、pH8)。具体的，所述黄曲霉毒素M1核酸适体Apt为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。具体的，所述单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCATGTGGAAAATCTCTA-3’。本专利技术的检测原理如下：先让Apt与ssDNA杂交形成Apt-ssDNA杂交链；当有黄曲霉毒素M1存在时，杂交链Apt-ssDNA与AFM1反应生成Apt—AFM1同时释放出信号探针ssDNA；体系中存在Apt-ssDNA(剩余的)、Apt-AFM1和信号探针ssDNA。Apt-AFM1不能诱导银离子还原生成近红外荧光的银纳米簇，对测定无干扰；杂交链Apt-ssDNA可能有干扰；为了消除杂交链Apt-ssDNA的干扰：a.杂交链Apt-ssDNA经DNA扩增形成双链DNA；b.双链DNA在核酸外切酶选择性地催化作用下迅速水解成单核苷酸而消除，体系中的单链信号探针ssDNA不水解(水解速度极缓慢)而被保留下来。此时体系中有可诱导生成近红外荧光的银纳米簇的ssDNA。向体系中加入柠檬酸钠溶液、银离子和还原剂，银离子在单链信号探针ssDNA的诱导下生成被ssDNA修饰的近红外银纳米簇；通过检测体系近红外荧光强度，依据近红外荧光强度与AFM1的量的关系，测定真菌毒素黄曲霉毒素M1的含量。由于消除了体系中背景荧光的干扰，可以提高检测的灵敏度和精度。本专利技术的目的之二在于提供一种检测黄曲霉毒素M1的试剂盒，该试剂盒包括黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液、单链信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系；其中，所述黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液的黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的物质含量浓度、溶液体积与单链信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液的单链信号探针ssDNA的物质含量浓度、溶液体积均相同。具体的，所述黄曲霉毒素M1核酸适体Apt为5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′。具体的，所述单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCATGTGGAAAATCTCTA-3’。具体的，所述DNA扩增体系包括扩增缓冲溶液、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液dNTP(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测黄曲霉毒素M1的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)先分别将含黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液和含单链信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液置于90℃水浴中加热5分钟后，迅速置于冰浴中保持5分钟；分别取上述处理过的3.0μmol黄曲霉毒素M1核酸适体Apt溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA溶液40μL混合，在37℃反应1h，形成杂交链Apt‑ssDNA；(2)向该杂交链Apt‑ssDNA体系中加入待测样品，当待测样品中有黄曲霉毒素M1即AFM1时，Apt‑ssDNA中的Apt选择性地与AFM1反应生成Apt‑AFM1，同时释放出单链信号探针ssDNA；(3)剩余Apt‑ssDNA的去除：向步骤(2)体系中依次加入10μL扩增缓冲溶液、18μL dNTP(10mM)和2μL Phi29 DNA聚合酶(10u/μl)，在37℃下反应8分钟；体系中剩余的Apt‑ssDNA经DNA扩增形成双链DNA；接着再向该反应体系中加入2μL Exo III核酸外切酶(20u/μL)和10μL NH4F(25mM)‑NaCl(0.1M)溶液，双链DNA在核酸外切酶选择性地催化作用下迅速水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA被保留下来，从而消除剩余杂交链Apt‑ssDNA的干扰；其中，所述扩增缓冲溶液组成为50mM Tris‑HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，pH 7.5；(4)利用Apt‑AFM1不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能够诱导银离子还原生成强荧光的近红外银纳米簇的原理，检测银离子还原检测体系近红外荧光的强度，依据荧光强度与AFM1的量的关系，测定待测样品中的黄曲霉毒素M1即AFM1的含量；其中，所述银离子还原检测体系包括先后添加的150μL柠檬酸钠溶液(10mM，pH 8)、10μL银离子溶液(2.5mmol)和使银离子迅速还原成近红外荧光银纳米簇的120μL+4价硫无机化合物还原剂(1mM、pH 8)。...

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素M1的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)先分别将含黄曲霉毒素M1核酸适体Apt的Tris缓冲溶液和含单链
信号探针ssDNA的Tris缓冲溶液置于90℃水浴中加热5分钟后，迅速置于冰
浴中保持5分钟；分别取上述处理过的3.0μmol黄曲霉毒素M1核酸适体Apt
溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA溶液40μL混合，在37℃反应1h，形成
杂交链Apt-ssDNA；
(2)向该杂交链Apt-ssDNA体系中加入待测样品，当待测样品中有黄曲
霉毒素M1即AFM1时，Apt-ssDNA中的Apt选择性地与AFM1反应生成Apt-
AFM1，同时释放出单链信号探针ssDNA；
(3)剩余Apt-ssDNA的去除：向步骤(2)体系中依次加入10μL扩增缓
冲溶液、18μLdNTP(10mM)和2μLPhi29DNA聚合酶(10u/μl)，在37℃
下反应8分钟；体系中剩余的Apt-ssDNA经DNA扩增形成双链DNA；接着
再向该反应体系中加入2μLExoIII核酸外切酶(20u/μL)和10μLNH4F
(25mM)-NaCl(0.1M)溶液，双链DNA在核酸外切酶选择性地催化作用下
迅速水解成单核苷酸，体系中单链信号探针ssDNA被保留下来，从而消除剩
余杂交链Apt-ssDNA的干扰；其中，所述扩增缓冲溶液组成为50mMTris-HCl，
10mMMgCl2，10mM(NH4)2SO4，pH7.5；
(4)利用Apt-AFM1不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有
单链信号探针ssDNA能够诱导银离子还原生成强荧光的近红外银纳米簇的原
理，检测银离子还原检测体系近红外荧光的强度，依据荧光强度与AFM1的量
的关系，测定待测样品中的黄曲霉毒素M1即AFM1的含量；其中，所述银离
子还原检测体系包括先后添加的150μL柠檬酸钠溶液(10mM，pH8)、10μL

\t银离子溶液(2.5mmol)和使银离子迅速还原成近红外荧光银纳米簇的120μL+4
价硫无机化合物还原剂(1mM、pH8)。
2.根据权利要求1所述检测黄曲霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾云龙，邓克勤，刘婷，易守军，黄昊文，夏晓东，唐春然，
申请(专利权)人：湖南科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43