一种直肠癌放疗抵抗细胞模型及其构建方法技术

一种细胞模型的构建方法，其为用梯度增加X射线照射量的方法，获得直肠癌放疗抵抗的细胞株。该细胞株源自于SW480细胞，抵抗细胞在高剂量辐射和低剂量辐射的抵抗性均高于亲本SW480细胞株。

Radiation resistant cell model for rectal cancer and its construction method

The invention relates to a method for constructing a cell model, which is used to obtain the cell line of radiation resistance of rectal cancer by the method of increasing the amount of X ray irradiation by gradient. The cell line was derived from SW480 cells, and the resistance of resistant cells to high dose and low dose radiation was higher than that of SW480 cells.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞领域，具体地属于细胞模型的构建。
技术介绍
近年来，随着人们生活水平的不断提高，直肠癌的发病率逐年上升。由于直肠解剖位置的特殊性，早期肿瘤不易被发现，大多数患者就诊时已处于局部中晚期，这部分患者单纯手术切除后复发率较高，而放射治疗作为一种重要的局部治疗手段，其与手术的联合能明显的降低局部复发率，提高患者的长期生存。但在临床治疗过程中，我们也观察到并非所有直肠癌患者都对放射治疗敏感，直肠癌细胞对X射线反应的异质性，影响了放射治疗的临床应用和疗效，放射抵抗成为目前制约直肠癌疗效提高的“瓶颈”。肿瘤放疗抵抗的产生是一个多基因共作用、多因子共介导和多机制共调控的复杂过程，放射治疗过程中细胞出现对放射线抵抗的细胞成分是肿瘤放疗抵抗产生的重要原因。已有的研究显示，DNA修复基因蛋白表达量增高、细胞乏氧效应、放疗后的促血管生成效应以及自噬调节是肿瘤细胞对抗放射线的主要途径。对p53、bcl-2、ATM等放疗相关基因的探索以及表皮生长因子受体(EGFR)、转化生长因子(TGF-β)、缺氧诱导因子(HIF-1а)和热休克蛋白(HSP70/90)等放疗相关因子的发现，使直肠癌放疗抵抗的研究取得了一定的进展，但放疗抵抗的具体机制仍不明确，尚需进一步深入探讨。研究证实，电离辐射可诱发肿瘤细胞启动放射保护机制从而获得继发性放射抵抗，导致肿瘤复发率增高或治疗失败。通过X射线对细胞反复筛选获得具有放疗抗性的细胞株，与同一来源的亲本细胞进行对照研究，是一种研究获得性放射抵抗机制的重要研究方法。目前，针对多种肿瘤细胞已有成功建立获得性放疗抵抗细胞株的报道，其主要采用“小剂量长程诱导法”或“大剂量短程筛选法”建株。其中，“小剂量长程诱导法”通常是以2Gy剂量反复照射肿瘤细胞约30次，诱导肿瘤细胞中产生放疗抵抗的细胞亚群，该过程耗时长，需要对细胞进行反复多次的处理，增加了污染的概率；而“大剂量短程筛选法”是通过单次或数次亚致死剂量的照射，使肿瘤细胞中放射抵抗的细胞亚群比率增高，进而筛选出放射抗拒的细胞亚群，该方法首先得通过一系列剂量点筛选出导致细胞亚致死损伤的剂量，在筛选过程细胞容易变形和死亡，建株细胞的放射生物学参数无法代表临床复发癌的放射抗性。
技术实现思路
我们同时采用“小剂量长程诱导法”、“大剂量短程筛选法”和“梯度照射法”对直肠癌细胞进行X射线照射，筛选得到了3组放疗抵抗的细胞株，通过放射生物学特性的检测，我们发现“梯度照射法”筛选的细胞株SW480-R，其放射抗拒性最强，并且筛选过程较短，细胞照射的次数少，能有效的降低污染的几率，同时有效的解决了采用亚致死剂量筛选导致的细胞变性和死亡等问题。我们采用“梯度照射法”建株，应用直线加速器对人直肠癌细胞株HT29进行放射线筛选，初次予以2Gy的X射线照射后，继续在37℃，饱和湿度，5％CO2孵箱中培养，胰酶消化传代。稳定传代一次后，再予以2GyX射线照射，培养同前，其后依次增加放疗剂量达4Gy，6Gy，8Gy和10Gy，每剂量均照射2次，总剂量达60Gy，照射后依然存活的细胞继续培养传代15天后，我们将筛选得到的细胞命名为放疗抵抗细胞株SW480-R。为证实SW480-R具有放疗抵抗性，我们采用CCK-8法检测不同放疗剂量下细胞生存率差异，利用细胞增殖试验和克隆形成试验检测细胞放射后增殖能力差异。CCK-8法是一种用以检测细胞活力的方法，与细胞活力和细胞数呈正相关，也可检测细胞增殖情况，较MTT法更快速、方便和稳定，不少研究都将用其分析肿瘤细胞的放疗敏感性。我们的试验显示，不同剂量照射后，SW480细胞生存率的下降趋势更明显，即SW480-R具有更高的生存率，其辐射抗性更高。为了进一步观察在同一剂量下不同时间点的增殖情况，我们采用细胞增殖实验进行检测，结果显示，射线对SW-480-R的生长抑制作用明显弱于SW480，放疗后的SW480-R的增长数目是SW480的两倍，表明SW480-R更具放疗抵抗性。克隆形成实验的评价细胞无限增殖能力的重要手段，也是测定被辐射后细胞增殖潜力的重要指标，而多靶单击和线性二次模型是公认的检测放疗抵抗性的生物学模型，其中D0反映细胞生存率从S降至0.37S所需的辐射量，是生存曲线的直线区域，为斜率的倒数，反映细胞在高剂量区对射线的敏感性；Dq为准阀值，反应肩区大小，其值预测细胞的修复能力，数值越小细胞对放射线越敏感；α值表示不能修复的损失的灭活细胞，其越大，辐射敏感性越高；а/β值提示组织的早晚反应性，与细胞的修复能力呈反比；SF2是指2Gy辐射量的细胞生存率，用以预测肿瘤和正常组织对分割放疗的反应，与放疗敏感性呈反比；MID值表示平均灭活剂量，本研究结果表明，SW480-R细胞在高剂量辐射和低剂量辐射的抵抗性均高于亲本SW480细胞株。本专利技术提供一种放疗抗性细胞株。进一步地，其源自SW480细胞。进一步地，其为由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNo.12671的细胞株。本专利技术还提供一种制备细胞株的方法，其特征在于包括如下步骤：1)用X射线照射细胞株；2)稳定传代后梯度增加X射线照射量；3)收集存活细胞株并传代。进一步地，第一次X射线照射量为2Gy，后续按照算术倍数增加。进一步地，总剂量不超过60Gy。进一步地，每一剂量照射两次。本专利技术还提供一种用上述方法制备得到的放疗抗性细胞株。具体实施方式辐射抵抗细胞株SW480-R建立一、方法1.细胞培养SW480细胞用含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)溶液的RPMI1640培养基接种于培养瓶中，置于37℃恒温培养箱中培养，CO2浓度5％，饱和湿度。细胞生长至80-90％时，用胰蛋白酶(0.125％)消化、计数并稀释至一定浓度予以传代。2.照射方法采用SiemensPRIMUS直线加速器，6MVX射线照射，源皮距为100cm，吸收剂量率为200cGy/min，培养板上覆盖1.5cm厚的硅胶补偿物。3.放射抗拒细胞株SW480-R的建立取指数生长期的结肠癌SW480细胞株，首次予以2Gy的X射线照射后，继续在37℃，饱和湿度，5％CO2孵箱中培养，胰酶消化传代。稳定传代1次后，再次予以2GyX射线照射，同前培养，再依次增加放疗剂量达4Gy,6Gy,8Gy和10Gy,每剂量均照射2次，总剂量达60Gy。此时依然存活的细胞不再予以放射处理，继续培养传代15天，传代大于5次，此时我们将筛选的细胞命名为SW480-R(SW480withresistance)。自初次照射细胞至筛选结束共5个月，后续试验使用细胞在5-10代之间。4.SW480-R细胞辐射抗性的鉴定4.1CKK-8检测细胞生存率CCK-8法是一种用以检测细胞活力的方法，与细胞活力和细胞数呈正相关，也可检测细胞增殖情况，较MTT法更快速、方便和稳定，不少研究都将用其分析肿瘤细胞的放疗敏感性。用0.125％的胰蛋白酶消化对数生长期的SW480和SW480-R细胞，以每孔3000个细胞接种于96孔板中，每个剂量设置三个复孔，待细胞贴壁12h后，分别用0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy和10Gy照射，持续培养4天后，每孔加入CCK-810μg\本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种放疗抗性细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种放疗抗性细胞株。2.如权利要求1所述的细胞株，其特征在于其源自SW480细胞。3.如权利要求1所述的细胞株，其特征在于，其为由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNo.12671的细胞株。4.一种制备如权利要求1所述细胞株的方法，其特征在于包括如下步骤：1)用X射线照射细胞株；2)稳定...

【专利技术属性】
技术研发人员：李懿，陈宏，杨祚璋，李秋恬，李英华，黄美金，宋锐，苏斌，
申请(专利权)人：李懿，
类型：发明
国别省市：云南;53