一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法。该方法先诱导表达并收集重组菌株E.coliBL‑22AB‑YDT的细胞和E.coli28LGOX的细胞，再将重组菌E.coli28LGOX的细胞和重组菌E.coliBL‑22AB‑YDT的细胞按1：1‑5混合后加入底物L‑赖氨酸和L‑谷氨酸，使L‑谷氨酸与L‑赖氨酸的摩尔比为1：0.5‑4，加入表面活性剂，全细胞催化生产戊二酸。本发明专利技术方法无需添加2‑酮戊二酸，降低了生产成本，解决了发酵法生产周期长，代谢产物复杂，底物转化率低，产物分离提取困难，及能耗高的问题，也解决了酶法催化中级联催化过程不易实现的不足，提高催化效率，同时省了酶纯化过程。

Method for producing glutaric acid by whole cell biocatalysis

The invention discloses a method for producing glutaric acid by whole cell biocatalysis. This method first collected and induced the expression of recombinant strain E.coliBL 22AB YDT cells and E.coli28LGOX cells, then the recombinant E.coli28LGOX cells and recombinant E.coliBL 22AB YDT cells by 1:1 5 mixed substrate is added to L lysine and L glutamate, L glutamic acid and L Lai is 1:0.5 molar ratio of amino acid 4, adding surfactant production glutaric acid catalyzed by whole cell. The method of the invention does not need to add 2 ketoglutarate, reduces the production cost, solve the production cycle of fermentation metabolites of long, complex, low conversion rate of substrate, extraction difficult product problems and high energy consumption, but also solve the enzymatic cascade catalytic process is not easy to realize the shortcomings, improve the catalytic at the same time, the efficiency of enzyme purification process.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法。
技术介绍
戊二酸，别名：胶酸，a,γ-丙烷二羧酸，1,3-丙二羧酸，可作为重要的化工原料和有机中间体，在各个方面具有广泛的应用。在工业中，戊二酸可用于合成聚氯乙烯、聚酯、聚酰胺以及聚氯乙烯的聚酯增塑剂等，另外也可以用于合成液态聚酯（改良PET纤维的分子结构，改进PET纤维的染色性，提高上染率）。在医药方面，戊二酸可用于合成各种杀菌消毒洗液及药品，另外，在生活中，戊二酸可用于去垢剂的配剂，粘合剂的配制，以及含硫等烟道气的洗涤等。目前合成戊二酸的方法中，有化学合成法，如以γ-丁内酯为原料的多步合成法，以环戊醇-环戊酮为原料的选择氧化法，以二氢呋喃为原料氧化水解开环，由丙二酸酯在二乙铵存在下与甲醛缩合制备等。但是此法原料较昂贵，不易得且大部分用到了强氧化剂，对设备的腐蚀很大。反应较为复杂，反应步骤很多，产率不高，环境污染较严重，只限于实验室，工业化前景不大。SiJaePark等人采用过表达了davAB和gabTD的重组E.coliWL3110菌株在含有20g/L葡萄糖，10g/LL-赖氨酸和10g/L2-酮戊二酸的培养基里发酵培养，得到了1.7g/L戊二酸。这种方法需要外源添加昂贵的氨基受体2-酮戊二酸，大大增加了生产成本，另外发酵法生产戊二酸摩尔收率较低，耗时较长，反应体系较复杂，产物分离较困难。JakeAdkins等人采用过表达了davAB和davDT的重组Escherichiacoli菌株以葡萄糖为底物，发酵48h后产生了0.82g/L的戊二酸，这种方法反应体系较复杂，戊二酸的摩尔收率较低。经检索，一种经济高效的双细胞耦合生产戊二酸的方法，尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法，该方法节约成本，经济高效。为解决现有技术问题，本专利技术采取的技术方案为：一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法，包括以下步骤：一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法，包括以下步骤：步骤1，构建过表达DavBA和gabDT的菌株E.coliBL-22AB-YDT，然后从平板上挑取重组菌株E.coliBL-22AB-YDT的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的5mlLB摇管里，培养6-8h后转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的100MLLB培养基里，培养至OD600=0.6-0.8，离心集菌，得到重组菌株E.coliBL-22AB-YDT的细胞；步骤2，构建过表达LGOX的菌株E.coli28LGOX，然后从平板上挑取重组菌株E.coli28LGOX的单菌落接种到含有卡那霉素抗性及LB的摇管里，培养6-8h后转接到含有卡那霉素抗性及LB的摇瓶里，培养至OD600=0.6-0.8，离心集菌，得到重组菌株E.coli28LGOX的细胞；步骤3，将重组菌E.coli28LGOX的细胞和重组菌E.coliBL-22AB-YDT的细胞按照比例1：1-5混合，加入底物L-赖氨酸（5-100g/L）和L-谷氨酸（5-100g/L），使L-谷氨酸与L-赖氨酸（5-100g/L）的摩尔比为1：0.5-4，加入表面活性剂，全细胞催化生产戊二酸。上述方法中优选的是，步骤1中过表达DavBA和gabDT菌株的构建步骤为：将davA及davB片段与表达载体pET-22b相连，得到重组质粒pET22b-DavBA，将重组质粒pET22b-DavBA导入E.coliBL21的感受态细胞中，得到过表达了davBA的重组菌E.coliBL-22BA并将该重组菌株做成感受态细胞，将gabD及gabT片段与表达载体pACYC-Duet相连，得到重组质粒pACYC-gabDT，将重组质粒导入重组菌E.coliBL-22AB的感受态细胞里，得到过表达了DavBA和gabDT的重组菌株E.coliBL-22AB-YDT。上述方法中优选的是，步骤2构建过表达LGOX的菌株E.coli28LGOX的方法是：将片段LGOX以NcoI和BamHI为酶切位点，与经NcoI和BamHI酶切过的表达载体28a相连，得到重组质粒28a-LGOX，将重组质粒导入E.coliBL21的感受态细胞中，得到过表达了LGOX的重组菌E.coli28LGOX。步骤3，重组菌株E.coliBL-22AB-YDT全细胞催化L-赖氨酸的过程与重组菌E.coli28LGOX全细胞催化L-谷氨酸的过程相耦合的方法将重组菌E.coli28LGOX和重组菌E.coliBL-22AB-YDT的细胞按照比例混合，加入底物L-赖氨酸和L-谷氨酸，并加入0.5%X-100，在37°C，200rmp条件下进行全细胞催化反应，每隔一定的时间取样，液相检测戊二酸及2-酮戊二酸的量；作为上述方法优选的是，步骤3中所述重组菌E.coli28LGOX和重组菌E.coliBL-22AB-YDT的细胞比例为1：4。作为上述方法优选的是，步骤3中所述的底物L-谷氨酸和底物L-赖氨酸的摩尔比1：2。作为上述方法优选的是，步骤3中所述的表面活性剂为SDS，TritonX-100，Tween-20，Tween-80中的一种或几种。作为表面活性剂优选的是，步骤3中L-赖氨酸和L-谷氨酸的浓度均为5-100g/L。作为上述方法优选的是，步骤3中催化反应在37℃，搅拌转速200rpm条件下进行。有益效果一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法，通过过表达L-谷氨酸氧化酶（LGOX），实现了以廉价的L-谷氨酸为底物生产高价值的氨基受体2-酮戊二酸（2-KG），解决了全细胞催化L-赖氨酸转化为戊二酸过程中，需要外源添加昂贵的氨基受体2-酮戊二酸的经济问题，同时，通过调节底物L-谷氨酸与底物L-赖氨酸的摩尔比，实现底物更有效的利用。另外通过调节重组菌E.coli28LGOX和重组菌E.coliBL-22AB-YDT的细胞OD600比值，使戊二酸的摩尔收率达到68.34%。附图说明图1为双细胞耦合生产戊二酸的原理图；图2为不同温度下诱导表达LGOX表达的SDS-PAGE图。图3全细胞催化L-谷氨酸转化为2-酮戊二酸与戊二酸过程的耦合。具体实施方式实施例1过表达DavBA和gabDT菌株的构建：（1）过表达了davBA的重组菌株E.coliBL-22AB由本实验室提供，将该重组菌株E.coliBL-22AB做成感受态细胞。（2）gabT由金唯智合成，酶切位点为NdeI和XhoI并连接在pACYC载体上，得到重组质粒pACYC-gabT,（3）gabD由金伟唯智合成,酶切位点为NcoI和HindIII，并连接在pACYC载体上，得到重组质粒pACYC-gabD。（4）将重组质粒pACYC-gabD经限制性内切酶NcoI和HindIII处理回收后，得到酶切位点为NcoI和HindIII的片段gabD，将该片段与经过相同限制性内切酶处理过的重组质粒pACYC-gabT相连，使用T4DNA连接酶25°C连接30min。（5）将上述连接液转入大肠杆菌Trans1-T1的感受态细胞里，涂布在带有35mg/L氯霉素抗性的LB平板，37°C过夜培养。（6）挑取（本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建过表达DavBA和gabDT的菌株E.coliBL‑22AB‑YDT，然后从平板上挑取重组菌株E.coliBL‑22AB‑YDT的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的5ml LB摇管里，培养6‑8h后转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的100MLLB培养基里，培养至OD600=0.6‑0.8，离心集菌，得到重组菌株E.coliBL‑22AB‑YDT的细胞；步骤2，构建过表达LGOX的菌株E.coli28LGOX，然后从平板上挑取重组菌株E.coli28LGOX的单菌落接种到含卡那霉素抗性及LB的摇管里，培养6‑8h后转接到含有卡那霉素抗性及LB的摇瓶里，培养至OD600=0.6‑0.8，离心集菌，得到重组菌株E.coli28LGOX的细胞；；步骤3，将重组菌E.coli28LGOX的细胞和重组菌E.coliBL‑22AB‑YDT的细胞按照比例1：1‑5混合，加入底物L‑赖氨酸和L‑谷氨酸，使L‑谷氨酸与L‑赖氨酸的摩尔比为1：0.5‑4，加入表面活性剂，全细胞催化生产戊二酸。...

【技术特征摘要】
1.一种全细胞生物催化生产戊二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建过表达DavBA和gabDT的菌株E.coliBL-22AB-YDT，然后从平板上挑取重组菌株E.coliBL-22AB-YDT的单菌落接种到含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的5mlLB摇管里，培养6-8h后转接到含有100mg/L氨苄青霉素抗性和35mg/L氯霉素抗性的100MLLB培养基里，培养至OD600=0.6-0.8，离心集菌，得到重组菌株E.coliBL-22AB-YDT的细胞；步骤2，构建过表达LGOX的菌株E.coli28LGOX，然后从平板上挑取重组菌株E.coli28LGOX的单菌落接种到含卡那霉素抗性及LB的摇管里，培养6-8h后转接到含有卡那霉素抗性及LB的摇瓶里，培养至OD600=0.6-0.8，离心集菌，得到重组菌株E.coli28LGOX的细胞；；步骤3，将重组菌E.coli28LGOX的细胞和重组菌E.coliBL-22AB-YDT的细胞按照比例1：1-5混合，加入底物L-赖氨酸和L-谷氨酸，使L-谷氨酸与L-赖氨酸的摩尔比为1：0.5-4，加入表面活性剂，全细胞催化生产戊二酸。2.根据权利要求1所述的全细胞生物催化生产戊二酸的方法，其特征在于：步骤1所述过表达DavBA和gabDT的菌株E.coliBL-22AB-YDT的构建方法是：将片段DavB以酶切位点NdeI和XhoI连接在载体22b上，得到重组质粒22b-DavB，将片段DavB以酶切位点AgeI和XmaI连接在重组质粒22b-DavB上，得到重组质粒22b-DavBA，另外，将片段gabT以酶切位点NdeI和XhoI连接在质粒p...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，蔡沛沛，王昕，应晗笑，王璟，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32