一种简易的高通量硫氧还蛋白活性检测方法技术

本发明专利技术涉及一种简易的高通量硫氧还蛋白活性检测方法。其所述方法的具体步骤为：1)配制测活液；2)测定Trx标准曲线；3)测活步骤：实验孔中，取样品和测活液放入孔中反应1小时，再加入终止缓冲液；对照孔中，取测活液放入孔中放置1小时，再加入终止缓冲液及样品；用酶标仪测定各孔412nm处的光吸收值；根据标准曲线对比，计算出样品中活性Trx含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的hTrx活力单位。与现有技术相比，本发明专利技术样本需求量少，特别适合血清、血浆检测，简化了检测操作步骤，降低了因检测程序复杂引入的检测结果的离散性、提高检测结果的准确性。

A simple method for detecting the activity of high throughput Thioredoxin

The present invention relates to a simple method for detecting the activity of high throughput thioredoxin. The specific steps of the method are as follows: 1) preparation of measuring liquid; 2) determination of Trx standard curve; 3) measuring steps: experimental hole, sample and measuring liquid into the hole in the reaction for 1 hours, then add the stop buffer control; Kong Zhong, measured liquid into the hole in 1 place to live hours, then add stop buffer and sample; absorbance microplate reader to determine the hole at 412nm light; according to the standard curve comparison, calculate the content and activity of Trx in the sample; to detect the protein concentration in the sample by Bradford method, calculate the unit activity of hTrx contained a protein in the sample unit weight. Compared with the prior art, the invention needs less samples, especially suitable for the detection of serum and plasma, simplifies the detection operation steps, reduce the accuracy of the discrete, improve the detection results for the detection result of the introduction of complex procedures.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析检测
，具体来说，涉及到一种简易的高通量硫氧还蛋白活性检测方法。
技术介绍
硫氧还蛋白(Trx)存在于所有活细胞中，与细胞生长与存活密切相关。硫氧还蛋白也会分泌到细胞外，存在于血液及细胞外液中。该蛋白活性变化与许多疾病的发生发展有关。目前，硫氧还蛋白ELISA试剂盒，是以免疫学反应为基础，依靠抗原、抗体的特异性反应，检测硫氧还蛋白的蛋白水平。然而，硫氧还蛋白极易被体内的代谢物、中间产物修饰改变活性，组织和细胞中硫氧还蛋白的蛋白水平，不能确切地反映硫氧还蛋白的功能状态。此外，ELISA试剂盒有独特的组织特异性，实验中可能用到不同来源的样本，需要辨别哪种ELISA试剂盒能测手中的样本。至今，实验室研究中，硫氧还蛋白的测活方法主要有两种：胰岛素测活法(Luthman,Biochemistry21:6628-6633；1982.)、终点法(Arner,MethodsEnzymol300:226-239.；1999.)及改良后的终点法(Wu,Y.Atherosclerosis212:351-355；2010.)。胰岛素测活法，适合酶动力学研究，不适合大批量样本的测定。终点法及改良后的终点法，各实验室所用的条件及标准不尽相同，步骤较复杂，所测得的结果难以比较。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种高灵敏度、高效且简便的高通量硫氧还蛋白活性检测方法。本专利技术所述的一种简易的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，所述检测方法采用四种试剂，分别为检测缓冲液、酶溶液、终止缓冲液和标准品；所述检测缓冲液为NADPH、底物、磷酸钾缓冲液；所述终止缓冲液为DTNB和盐酸胍缓冲液；所述标准品为人硫氧还蛋白；所述的底物为FITC-胰岛素；所述酶溶液为牛硫氧还蛋白还原酶溶液；所述方法的具体步骤为：1)配制测活液：检测时，现取检测缓冲液2.6ml、酶溶液0.09ml，混合配制成测活液；2)测定硫氧还蛋白标准曲线：取检测缓冲液，在其中加入血清白蛋白，使血清白蛋白质量浓度为0.1％，得标准品稀释液；将人硫氧还蛋白用标准品稀释液配制成0、1、2、3、4、5μg/ml六个浓度，作为标准液样品；每个浓度标准液样品取20μl，进行测活操作；计算每一个实验孔的A412nm减去对照孔的A412nm的吸光度差值，计算出实际的因标准液样品中人硫氧还蛋白参与反应而导致的吸光度的增加，并制作出A412nm对人硫氧还蛋白浓度的标准曲线；A412nm表示412nm处的吸光度值；3)根据标准曲线对比，计算出样品中活性硫氧还蛋白含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的人硫氧还蛋白活力单位。所述的测活操作为：取多个酶标条，固定于酶标条专用架上，分别设置对照孔和实验孔，每份样品需要1个对照孔和2个实验孔，记录各孔位置；实验孔中，取样品20μl和测活液30μl放入孔中，在37℃下反应1小时，再加入终止缓冲液150μl，在室温下继续反应5-10分钟；对照孔中，取测活液30μl放入孔中，在37℃下放置1小时，再加入终止缓冲液150μl及样品20μl，在室温下反应5-10分钟；用酶标仪测定各孔412nm处的光吸收值A412nm；样品中的人硫氧还蛋白活性＝(样品光吸收值–对照光吸收值)×稀释倍数。本专利技术所述的一种简易的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，所述血清白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。将所述的检测缓冲液、酶溶液、底物液和标准品分别盛装到容量依次为2ml、100μl、1.7ml及200μl塑料试剂瓶或EP管中，然后置于包装盒内得到高通量硫氧还蛋白活性检测试剂盒。与现有技术相比，本专利技术所述的的高通量硫氧还蛋白活性检测方法的样本需求量少，仅需20μl血清、血浆，特别适合血清、血浆检测，能非常专一地检测人血清或血浆硫氧还蛋白活性，标准曲线的线性范围在0～80ng；而且进一步简化了检测操作步骤，更好地满足自动检测设备基本流程配置的需要，进一步降低了因检测程序复杂引入的检测结果的离散性、提高检测结果的准确性。其解决了硫氧还蛋白活性检测试剂盒不适用于现行常用自动检测设备基本流程配置需要的问题，而且显著提高了检测灵敏度。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术所述的高通量硫氧还蛋白活性检测方法做进一步说明，但是本专利技术的保护范围并不限于此。实施例1一种简易的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，所述检测方法采用四种试剂，分别为检测缓冲液、酶溶液、终止缓冲液和标准品；所述检测缓冲液为NADPH、底物、磷酸钾缓冲液；所述终止缓冲液为DTNB和盐酸胍缓冲液；所述标准品为人硫氧还蛋白(hTrx1)；所述检测缓冲液中NADPH的浓度为2mM，底物的浓度为10μM，磷酸钾的浓度为250mM；所述的底物为FITC-胰岛素；所述终止缓冲液中DTNB的浓度为1mM，盐酸胍的浓度为8M；所述酶溶液是5μM的牛硫氧还蛋白还原酶溶液。所述方法的具体步骤为：1)配制测活液：检测时，现取检测缓冲液2.6ml、酶溶液0.09ml，混合配制成测活液；2)测定硫氧还蛋白标准曲线：取检测缓冲液，在其中加入人血清白蛋白，使人血清白蛋白质量浓度为0.1％，得标准品稀释液；将人硫氧还蛋白用标准品稀释液配制成0、1、2、3、4、5μg/ml六个浓度，作为标准液样品；每个浓度标准液样品取20μl，进行测活操作；计算每一个实验孔的A412nm减去对照孔的A412nm的吸光度差值，计算出实际的因标准液样品中人硫氧还蛋白参与反应而导致的吸光度的增加，并制作出A412nm对人硫氧还蛋白浓度的标准曲线；A412nm表示412nm处的吸光度值。所述的测活操作为：取多个酶标条，固定于酶标条专用架上，分别设置对照孔和实验孔，每份样品需要1个对照孔和2个实验孔，记录各孔位置；实验孔中，取样品20μl和测活液30μl放入孔中，在37℃下反应1小时，再加入终止缓冲液150μl，在室温下继续反应5-10分钟；对照孔中，取测活液30μl放入孔中，在37℃下放置1小时，再加入终止缓冲液150μl及样品20μl，在室温下反应5-10分钟；用酶标仪测定各孔412nm处的光吸收值A412nm；样品中的人硫氧还蛋白活性＝(样品光吸收值–对照光吸收值)×稀释倍数；3)根据标准曲线对比，计算出样品中活性硫氧还蛋白含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的人硫氧还蛋白活力单位。将上述检测缓冲液、酶溶液、底物液和标准品分别盛装到容量依次为2ml、100μl、1.7ml及200μl塑料试剂瓶中，然后置于包装盒内得到高通量硫氧还蛋白活性检测试剂盒。与现有技术相比，本专利技术所述的基于高通量试剂盒检测硫氧还蛋白活性的方法的样本需求量少，仅需20μl血清、血浆，特别适合血清、血浆检测，能非常专一地检测人血清或血浆硫氧还蛋白活性，标准曲线的线性范围在0～80ng；而且进一步简化了检测操作步骤，更好地满足自动检测设备基本流程配置的需要，进一步降低了因检测程序复杂引入的检测结果的离散性、提高检测结果的准确性。其解决了硫氧还蛋白活性检测试剂盒不适用于现行常用自动检测设备基本流程配置需要的问题，而且显著提高了检测灵敏度。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简易的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，其特征在于，所述检测方法采用四种试剂，分别为检测缓冲液、酶溶液、终止缓冲液和标准品；所述检测缓冲液为NADPH、底物、磷酸钾缓冲液；所述终止缓冲液为DTNB和盐酸胍缓冲液；所述标准品为人硫氧还蛋白；所述的底物为FITC‑胰岛素；所述酶溶液为牛硫氧还蛋白还原酶溶液；所述方法的具体步骤为：1)配制测活液：检测时，现取检测缓冲液2.6ml、酶溶液0.09ml，混合配制成测活液；2)测定硫氧还蛋白标准曲线：取检测缓冲液，在其中加入血清白蛋白，使血清白蛋白质量浓度为0.1％，得标准品稀释液；将人硫氧还蛋白用标准品稀释液配制成0、1、2、3、4、5μg/ml六个浓度，作为标准液样品；每个浓度标准液样品取20μl，进行测活操作；计算每一个实验孔的A412nm减去对照孔的A412nm的吸光度差值，计算出实际的因标准液样品中人硫氧还蛋白参与反应而导致的吸光度的增加，并制作出A412nm对人硫氧还蛋白浓度的标准曲线；A412nm表示412nm处的吸光度值；3)根据标准曲线对比，计算出样品中活性硫氧还蛋白含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的人硫氧还蛋白活力单位。...

【技术特征摘要】
1.一种简易的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，其特征在于，所述检测方法采用四种试剂，分别为检测缓冲液、酶溶液、终止缓冲液和标准品；所述检测缓冲液为NADPH、底物、磷酸钾缓冲液；所述终止缓冲液为DTNB和盐酸胍缓冲液；所述标准品为人硫氧还蛋白；所述的底物为FITC-胰岛素；所述酶溶液为牛硫氧还蛋白还原酶溶液；所述方法的具体步骤为：1)配制测活液：检测时，现取检测缓冲液2.6ml、酶溶液0.09ml，混合配制成测活液；2)测定硫氧还蛋白标准曲线：取检测缓冲液，在其中加入血清白蛋白，使血清白蛋白质量浓度为0.1％，得标准品稀释液；将人硫氧还蛋白用标准品稀释液配制成0、1、2、3、4、5μg/ml六个浓度，作为标准液样品；每个浓度标准液样品取20μl，进行测活操作；计算每一个实验孔的A412nm减去对照孔的A412nm的吸光度差值，计算出实际的因标准液样品中人硫氧还蛋白参与反应而导致的吸光度的增加，并制作出A412nm对人硫氧还蛋白浓度的标准曲线；A412nm表示412nm处的吸光度值；3)根据标准曲线对比，计算出样品中活性硫氧还蛋白含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁巍，刘军，杜澄，
申请(专利权)人：北京中科研源科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11