一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法，包括如下步骤：将哺乳动物皮肤的真皮层、生石灰、水混合，室温下震荡；用洗脱液洗脱；冻干，破碎成颗粒；将颗粒与含胃蛋白酶的乙酸溶液混合，搅拌、离心，取上清；盐析沉淀胶原蛋白并纯化；再溶解于乙酸溶液中，调节pH至1‑5，注入模具中冷冻干燥，交联处理，包装、灭菌后得到胶原蛋白海绵产品。本发明专利技术通过两步法即可直接提取高纯度原材料，并在胶原蛋白海绵的制备过程中，摒弃对胶原蛋白溶液pH中性的硬性要求，摸索出在低pH的条件下，能制备出理想的胶原蛋白海绵，有效地简化了生产工艺、降低了制备成本。

Method for preparing collagen sponge under acidic condition

The invention discloses a preparation method of collagen sponge an acidic condition, which includes the following steps: mammalian dermis, lime, water, room temperature concussion; eluted with the eluent; freeze dried, crushed into particles; the particle mixing and containing pepsin acetic acid solution, stirring, centrifugal, take collagen and salting out precipitation supernatant; purification; and then dissolved in acetic acid solution, adjusted pH to 1 5 injection mold, freeze drying, crosslinking processing, packaging and sterilization by collagen sponge products. The invention can be directly through the two step extraction of high purity raw materials, and the collagen sponge in the preparation process, abandon the rigid requirements on collagen solution pH neutral, worked out under the condition of low pH, prepared collagen sponge ideal, effectively simplifies the production process, reduces the preparation cost.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学材料
，具体涉及一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法。
技术介绍
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，占体内蛋白质总量的25％-33％，骨、软骨、肌键及皮肤中胶原蛋白含量非常丰富。胶原蛋白的结构特点是具有三股螺旋结构，根据多肽链氨基酸组成和顺序的不同，胶原可细分为I型、II型、III型等27种类型。作为最有用的生物材料之一，胶原蛋白在生物医学材料领域具有广泛的应用前景。胶原蛋白海绵是一种新型的生物医学材料，由高纯度和低免疫原性的胶原蛋白制成。胶原蛋白海绵具备适当的孔径及三维结构，使得细胞在孔间进行自由迁移的同时还能有足够面积保持粘附作用。在临床上，胶原蛋白海绵可促进毛细血管的形成和肉芽组织的生长，用于创面止血愈合、缺损部位组织填充、人体器官的修复和再生等。目前胶原蛋白海绵的制备工艺主要包括以下几个步骤：原料预处理——胶原蛋白初提——盐析纯化——胶原蛋白再溶解——注模定型——交联——冷冻干燥。胶原蛋白的现有提取步骤中，往往采用冻融、高渗、液体高压、超声、蛋白酶消化等方法来实现脱细胞的目的，操作过程繁琐且不彻底。有的甚至直接购买市售胶原蛋白粉进行胶原蛋白海绵的制备，成本高昂。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法，以解决现有技术的不足。本专利技术采用以下技术方案：一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法，包括如下步骤：步骤一、取新鲜哺乳动物皮肤的真皮层，洗涤、晾干；步骤二、将步骤一获得的真皮层、生石灰、水混合，在室温下震荡1-2h；其中，生石灰和水的质量体积比为1-5g:100ml，真皮层浸没溶液中；步骤三、从步骤二的溶液中取出真皮层，洗涤后浸没到洗脱液中，室温震荡24-48h，期间多次换洗脱液；步骤四、从步骤三的洗脱液中取出真皮层，洗涤冻干后，破碎成颗粒；步骤五、将步骤四制备的颗粒与含0.1-1mg/ml胃蛋白酶的0.1-1mol/L乙酸溶液混合，37℃搅拌30-48小时，离心，取上清液；其中，颗粒和乙酸溶液的质量体积比为1-12mg:1mL；步骤六、往步骤五的上清液中加入NaCl至其终浓度为1-3mol/L，在2-6℃下静置12-24小时，离心，弃上清，得到胶原蛋白；步骤七、将步骤六得到的胶原蛋白溶解于0.1-1mol/L乙酸溶液中，置于透析袋透析去盐，将去盐的胶原蛋白溶液低温干燥后即获得精制胶原蛋白粉；步骤八、将步骤七制得的精制胶原蛋白粉溶解于0.1-1mol/L乙酸溶液中，胶原蛋白粉和乙酸溶液的质量体积比为3-12mg:1mL，调节pH至1-5；将胶原蛋白溶液注入模具中，冷冻干燥，得到胶原蛋白海绵材料；步骤九、利用化学或物理交联法对胶原蛋白海绵进行交联处理；步骤十、将交联处理后的胶原蛋白海绵包装、灭菌得到胶原蛋白海绵产品。进一步地，步骤三中洗脱液包括5％Tween-80、5％Tween-20、1％TritonX-100或1％SDS。进一步地，步骤八中胶原蛋白溶液注入模具后，冰冻后，在-20—-50℃下冷冻干燥48小时以上。进一步地，步骤九中化学交联法的交联剂包括戊二醛、京尼平、谷氨酰胺转氨酶或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；物理交联法包括紫外交联法或高温交联法。进一步地，步骤十中用16-25kGy强度的Co60辐照灭菌。本专利技术的有益效果：1、相较于现有技术，本专利技术通过两步法(步骤二和步骤三)即可直接提取高纯度原材料；并在胶原蛋白海绵的制备过程中，摒弃对胶原蛋白溶液pH中性的硬性要求，摸索出在低pH的条件下，能制备出理想的胶原蛋白海绵，有效地简化了生产工艺、降低了制备成本。2、本专利技术原材料及试剂易获得，且成本低廉，生产工艺步骤相对较少，简单有效。附图说明图1为实施例1制备的胶原蛋白海绵产品的外观。图2为实施例1制备的胶原蛋白海绵产品的扫描电镜图(×100)。图3为实施例1制备的胶原蛋白海绵产品的扫描电镜图(×1000)。图4为实施例2制备的胶原蛋白海绵产品的扫描电镜图(×100)。图5为实施例2制备的胶原蛋白海绵产品的扫描电镜图(×1500)。图6为实施例3制备的胶原蛋白海绵产品的扫描电镜图(×100)。图7为实施例3制备的胶原蛋白海绵产品的扫描电镜图(×1000)。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本专利技术，但并不用来限定本专利技术的实施范围。一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法，包括如下步骤：步骤一、获取新鲜哺乳动物的皮肤，刮毛去脂，电动取皮刀获得真皮层，清水洗涤，晾干。步骤二、将步骤一获得的真皮层、生石灰、水混合，在室温下震荡1-2h；其中，生石灰和水的质量体积比为1-5g:100ml，真皮层浸没溶液中。生石灰的作用有杀灭病原体，除DNA，去油脂，裂解细胞，兼消毒。生石灰处理哺乳动物皮肤原料有益于得到高纯度的胶原蛋白，且成本低廉。步骤三、从步骤二的溶液中取出真皮层，洗涤后浸没到洗脱液中，室温震荡24-48h，每隔12h换液一次；洗脱液包括5％Tween-80、5％Tween-20、1％TritonX-100或1％SDS。洗脱液的作用在于洗脱残留细胞碎片，保证处理后留下高纯度的胶原蛋白。步骤四、从步骤三的洗脱液中取出真皮层，洗涤、冻干后破碎成颗粒。步骤五、将步骤四制备的颗粒与含0.1-1mg/ml胃蛋白酶的0.1-1mol/L乙酸溶液混合，37℃搅拌30-48小时，12000rpm离心20min，取上清液；其中，颗粒和乙酸溶液的质量体积比为1-12mg:1mL。胃蛋白酶可催化水解胶原的端肽非螺旋区，对螺旋区无作用，这样溶解的胶原具有完整的三螺旋结构，同时降低了胶原蛋白的抗原性。步骤六、往步骤五的上清液中加入NaCl至其终浓度为1-3mol/L，在2-6℃下静置12-24小时，8000rpm离心20min，弃上清，得到胶原蛋白。步骤七、将步骤六得到的胶原蛋白溶解于0.1-1mol/L乙酸溶液中，置于透析袋透析去盐，将去盐的胶原蛋白溶液低温干燥后即获得精制胶原蛋白粉。步骤八、将步骤七制得的精制胶原蛋白粉溶解于0.1-1mol/L乙酸溶液中，胶原蛋白粉和乙酸溶液的质量体积比为3-12mg:1mL，调节pH至1-5；将胶原蛋白溶液注入模具中，冰冻后，在-20—-50℃下冷冻干燥48小时以上，得到胶原蛋白海绵材料。步骤九、利用化学或物理交联法对胶原蛋白海绵进行交联处理；化学交联法的交联剂包括戊二醛、京尼平、谷氨酰胺转氨酶或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；物理交联法包括紫外交联法或高温交联法。步骤十、将交联处理后的胶原蛋白海绵包装后用16-25kGy强度的Co60辐照灭菌得到胶原蛋白海绵产品。实施例1一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法，包括如下步骤：步骤一、获取新鲜哺乳动物(如猪、牛)的皮肤，刮毛去脂，电动取皮刀获得真皮层，清水洗涤，晾干。步骤二、将步骤一获得的真皮层、生石灰、水混合，在室温下震荡1.5h；其中，生石灰和水的质量体积比为3g:100ml，真皮层浸没溶液中。步骤三、从步骤二的溶液中取出真皮层，洗涤后浸没到洗脱液5％Tween-80中，室温震荡36h，每隔12h换液一次。步骤四、从步骤三的洗脱液中取出真皮层，洗涤冻干后，破碎成颗粒。步骤五、将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、取新鲜哺乳动物皮肤的真皮层，洗涤、晾干；步骤二、将步骤一获得的真皮层、生石灰、水混合，在室温下震荡1‑2h；其中，生石灰和水的质量体积比为1‑5g:100ml，真皮层浸没溶液中；步骤三、从步骤二的溶液中取出真皮层，洗涤后浸没到洗脱液中，室温震荡24‑48h，期间多次换洗脱液；步骤四、从步骤三的洗脱液中取出真皮层，洗涤冻干后，破碎成颗粒；步骤五、将步骤四制备的颗粒与含0.1‑1mg/ml胃蛋白酶的0.1‑1mol/L乙酸溶液混合，37℃搅拌30‑48小时，离心，取上清液；其中，颗粒和乙酸溶液的质量体积比为1‑12mg:1mL；步骤六、往步骤五的上清液中加入NaCl至其终浓度为1‑3mol/L，在2‑6℃下静置12‑24小时，离心，弃上清，得到胶原蛋白；步骤七、将步骤六得到的胶原蛋白溶解于0.1‑1mol/L乙酸溶液中，置于透析袋透析去盐，将去盐的胶原蛋白溶液低温干燥后即获得精制胶原蛋白粉；步骤八、将步骤七制得的精制胶原蛋白粉溶解于0.1‑1mol/L乙酸溶液中，胶原蛋白粉和乙酸溶液的质量体积比为3‑12mg:1mL，调节pH至1‑5；将胶原蛋白溶液注入模具中，冷冻干燥，得到胶原蛋白海绵材料；步骤九、利用化学或物理交联法对胶原蛋白海绵进行交联处理；步骤十、将交联处理后的胶原蛋白海绵包装、灭菌得到胶原蛋白海绵产品。...

【技术特征摘要】
1.一种酸性条件下胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、取新鲜哺乳动物皮肤的真皮层，洗涤、晾干；步骤二、将步骤一获得的真皮层、生石灰、水混合，在室温下震荡1-2h；其中，生石灰和水的质量体积比为1-5g:100ml，真皮层浸没溶液中；步骤三、从步骤二的溶液中取出真皮层，洗涤后浸没到洗脱液中，室温震荡24-48h，期间多次换洗脱液；步骤四、从步骤三的洗脱液中取出真皮层，洗涤冻干后，破碎成颗粒；步骤五、将步骤四制备的颗粒与含0.1-1mg/ml胃蛋白酶的0.1-1mol/L乙酸溶液混合，37℃搅拌30-48小时，离心，取上清液；其中，颗粒和乙酸溶液的质量体积比为1-12mg:1mL；步骤六、往步骤五的上清液中加入NaCl至其终浓度为1-3mol/L，在2-6℃下静置12-24小时，离心，弃上清，得到胶原蛋白；步骤七、将步骤六得到的胶原蛋白溶解于0.1-1mol/L乙酸溶液中，置于透析袋透析去盐，将去盐的胶原蛋白溶液低温干燥后即获得精制胶原蛋白粉；步骤八、将步骤七制得的精制胶原蛋白粉溶解于0.1-1m...

【专利技术属性】
技术研发人员：董伟仁，李锋，潘若浪，戴玲华，王金福，
申请(专利权)人：杭州易文赛科拓干细胞技术研究有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33