一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种HER2、EGFR、EpCAM多重抗体免疫磁珠及其制备方法，所述多重抗体免疫磁珠由HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠组成，其中HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠分别为HER2抗体、EGFR抗体和EpCAM抗体和磁性微球偶联得到的免疫磁珠。将本发明专利技术的多重抗体免疫磁珠用于捕获CTC，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。而且免疫磁珠的性质稳定，同时粒径小，磁响应性好，分散性好。并且制备方法简单，具有很强的实用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫磁珠的制备领域，具体地说是一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠及其制备方法。
技术介绍
上皮组织包括覆盖上皮、腺上皮和导管上皮，发生的肿瘤称为上皮性肿瘤，人类的恶性肿瘤大部分来源于上皮组织。虽然我国对于肿瘤的早期诊断和治疗手段已经取得了明显的进步，但是复发和转移仍然是影响患者5年生存率的主要原因。因此有必要对肿瘤细胞进行进一步的分析，以了解其发生、发展和转移的机制。免疫磁珠分选法(Immunomagneticseparation，IMS)是近年来兴起的一种用于细胞分选的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原-抗体反应，在细胞表面形成“抗原-抗体-磁珠”免疫复合物。这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下，就会定向移动，使免疫复合物与其他未被结合的细胞分群。当具超顺磁性的磁珠脱离磁场后，磁性立即消失，从而达到阳性或阴性选择特定细胞的目的。将免疫磁珠分选法应用于肿瘤细胞的分选是本领域近年来兴起的技术。但是利用免疫磁珠分选法从复杂的环境中分选出肿瘤细胞，需要免疫磁珠具有特异性、敏感性的生物标志物，而且稳定性、分散性好，不能团聚。同时，免疫磁珠的粒径不能过大，过大会压迫肿瘤细胞；免疫磁珠的粒径也不能过小，粒径过小磁响应性也小，容易无法达到肿瘤细胞分选的效果。EpCAM(上皮细胞粘附分子)可以区分上皮和非上皮来源的组织，作为肿瘤细胞表面的生物标志物(倪亚平.EpCAM与肿瘤关系的研究进展[J].医学综述,2012,18(21):3579-3582.)。然而基于EpCAM的检测在阴性EpCAM癌症的时候敏感性却很低，因此转移性上皮性肿瘤高达70％不能将EpCAM作为生物标志物分选。特别是当侵袭性肿瘤细胞，在丢失某些上皮细胞的表型，发生上皮-间质转化的过程时，EpCAM的表达通常下调。为了能够有效的捕获和分选上皮性肿瘤细胞，可以采用多生物标志物联用的方式增加捕获效率，如公开日为2014年9月26日，公开号为CN105087493A的中国专利中公开了一种将HLA-G、EpCAM和CK8/18联合作为生物标志物，将抗体与磁珠偶联后用于肿瘤细胞的分选。但是该方法不针对上皮性肿瘤细胞，而且采用美天旎公司、Kisker公司生产的磁珠，需要采用配套的分选器，成本过高。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠，磁珠粒径小，磁响应性好，而且用本专利技术的免疫磁珠进行肿瘤细胞捕获，富集时间短，捕获的肿瘤细胞富集率高，减少了结果的假阴性，同时多重抗体免疫磁珠的制备过程简单，成本低。在本专利技术的一方面，本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠，所述多重抗体免疫磁珠由HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠组成，其中HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠分别为HER2抗体、EGFR抗体、EpCAM抗体和MUC1抗体与磁性微球偶联得到的免疫磁珠。进一步的，所述HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示HER2、EGFR、EpCAM、MUC1抗体，或者A表示HER2、EGFR、EpCAM、MUC1抗体，B表示磁性微球。优选的，所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等。最优选的，所述磁性微球为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。在本专利技术的第二方面，提供了一种制备所述HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：s1.磁性纳米簇的制备；s2.氨基修饰的磁性微球的制备；s3.肼基修饰的A部分的制备；s4.醛基修饰的B部分的制备；s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠。在本专利技术的一种实施方式中，对氨基修饰的磁性微球部分进行醛基修饰，并且对HER2抗体、EGFR抗体、EpCAM抗体和MUC1抗体分别进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰，并且对HER2抗体、EGFR抗体、EpCAM抗体和MUC1抗体分别进行醛基修饰，均可以实现上述结构的免疫磁珠。进一步的，所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。所述SANH为对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：362522-50-7)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本专利技术一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对抗体的修饰反应时间2～4h。进一步的，所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。所述SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS：60444-78-2)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球部分或抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本专利技术一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对抗体的修饰反应时间2～4h。所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术，得到的产品只需要满足具有良好的磁性，并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。作为优选的，所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：1)在空气中，向二价铁盐的水溶液中加入氨水，然后搅拌使溶液变成黑色，得到黑色Fe3O4颗粒；2)向步骤1)中加入油酸，混合均匀后转移至密闭的反应釜中，在60～130℃下加热反应3～5小时，即可得到所述磁性纳米簇。进一步的，所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球部分为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加优于直接在磁性纳米簇粒子表面进行氨基修饰得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本领域技术人员所知的常规方法制备，均不影响本专利技术的结果。可以使纳米簇聚集在二氧化硅内部，形成核壳结构，增大粒径，并且增加磁性和稳定性即可。优选的，本专利技术采用如下方法制备氨基修饰的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的质量比为：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的质量百分浓度为25～28％。其中，硅烷化试剂可以为正硅酸四乙酯(CAS：562-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠，其特征在于：所述多重抗体免疫磁珠由HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠组成，其中HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠分别为HER2抗体、EGFR抗体、EpCAM抗体和MUC1抗体与磁性微球偶联得到的免疫磁珠。

【技术特征摘要】
1.一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠，其特征在于：所述多重抗体免疫磁珠由HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠组成，其中HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠分别为HER2抗体、EGFR抗体、EpCAM抗体和MUC1抗体与磁性微球偶联得到的免疫磁珠。2.根据权利要求1所述的HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠，其特征在于：所述HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示HER2、EGFR、EpCAM、MUC1抗体，或者A表示HER2、EGFR、EpCAM、MUC1抗体，B表示磁性微球。3.根据权利要求1所述的HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠，其特征在于：所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。4.一种制备权利要求1-3中任一项所述HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：s1.磁性纳米簇的制备；s2.氨基修饰的磁性微球的制备；s3.肼基修饰的A部分的制备；s4.醛基修饰的B部分的制备；s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到HER2免疫磁珠、EGFR免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠和MUC1免疫磁珠。5.根据权利要求4所述HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌岳，蔡红东，张祥林，李静，刘关，
申请(专利权)人：上海美吉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31