本发明专利技术涉及分子生物学及生物检测领域，具体公开了基于环介导等温扩增消光技术的转基因水稻KMD1检测引物及检测方法与试剂盒。本发明专利技术针对转基因水稻KMD1转化事件3’端基因的6个区域设计4条特异性引物，利用环介导等温扩增消光技术使用所述引物对样品的DNA进行扩增，通过判定反应颜色或吸光值的变化判断是否有扩增产物，从而判断是否存在转基因水稻KMD1。所述方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、肉眼判定结果等优点，为转基因水稻KMD1检测提供了有效、快速的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学及生物检测领域，具体地说，涉及基于环介导等温扩增消光技术的转基因水稻KMD1检测引物及检测方法与试剂盒。
技术介绍
浙江农业大学核农所教授高明尉等带领课题组利用农杆菌介导法，在世界上首次培育成功转基因抗螟虫品系克螟稻(KMD)。从1995年起，浙大的科学家们通过与加拿大渥太华大学合作，成功地将抗螟虫基因转入了水稻植株，并于1998年获得了抗螟虫的种质资源KMD1。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplificationmethod，LAMP)是Notomi等于2000年专利技术的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在等温条件下(60-65℃)反应，在1h内即可完成核酸扩增反应，目的片段可以扩增109倍。该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、省时、操作简单等优点，在核酸检测方面具有明显优势。目前环介导等温检测技术的产物检测方法主要有浊度法、染料法、电泳法以及核酸试纸条，但是这些方法都容易引起交叉污染。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供基于环介导等温扩增消光技术的转基因水稻KMD1检测引物及检测方法与试剂盒。该检测方法操作简便，不依赖昂贵仪器且对操作人员要求低，方法准确无污染。针对转基因水稻KMD1的转化事件3’端基因检测，可实现对待测样品中转基因水稻KMD1成分的现场快速检测。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术针对转基因水稻KMD1转化事件3’端为靶基因设计了基于环介导等温扩增消光技术的转基因水稻KMD1检测引物，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物，序列分别为：上游外引物KMD1-F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGCGGCGATGGCGATGC；下游外引物KMD1-B3：CTGGGAGGGAGGGAGGGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT；上游内引物KMD1-FIP：TATCCCGAGATGGGCAGGCACTGGGAGGGAGGGAGGGCCAACTGCGGCGGGT；下游内引物KMD1-BIP：TTGTGGTGTAAACAAATTGACGCCTGGGAGGGAGGGAGGGGAAAAGAAAAACCACCCCAGTAC。核酶是一种具有类过氧化物酶活性、富含鸟嘌呤的单链DNA分子，在特定的条件下能够折叠成G4重结构，在H2O2存在下能够催化无色底物2，2′-连氮基-双-(3-乙基并二氢噻唑啉-6-磺酸)二价阴离子(ABTS2-)氧化成蓝绿色物质ABTS-·自由基。当存在单链DNA分子的互补链时，这种类过氧化物酶的活性降低甚至消失。将折中显色/消光技术结合到环介导等温扩增技术上，利用引物显色，产物消光的手段，来验证目的片段的存在。本专利技术通过巧妙地设计引物，使引物既可高效扩增转基因水稻KMD1转化事件3’端，又可作为具有类过氧化物酶活性单链DNA核酶，实现上述功能。第二方面，本专利技术提供了一种扩增效率高、准确度高的检测转基因水稻KMD1的方法，即利用环介导等温扩增消光技术用前述引物对样品的DNA进行扩增，通过检测是否有扩增产物来判断是否存在KMD1转化事件，从而判断是否存在转基因水稻KMD1。有扩增产物时，判断样品中存在转基因水稻KMD1成分。具体包括如下步骤：(1)提取样品基因组模板：将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB方法提取基因组；(2)显色反应：将hemin工作液与前述引物混合，在35～45℃条件下孵育20～30min，添加ABTS显色液和H2O2后得到显色反应混合液，立刻判定颜色或通过紫外分光光度计在419nm处测定吸光值；(3)环介导等温扩增消光反应：向显色反应混合液中添加样品基因组模板，在60～65℃进行环介导等温扩增消光反应40～60min；(4)产物检测：目视判定反应颜色，或通过紫外分光光度计在419nm处测定吸光值，通过与步骤(2)得到的颜色或吸光值进行比较，判断是否有扩增产物。判定颜色由蓝色变浅或变为无色，或者吸光值减小，可判定有目的扩增产物。作为优选，步骤(2)中，将40～60μM的hemin工作液与1.25μM的KMD1-F3和KMD1-B3以及10μM的KMD1-FIP和KMD1-BIP混合，在35～45℃条件下孵育20～30min，添加30～40mM的ABTS显色液和50～60mM的H2O2后得到显色反应混合液，立刻判定颜色或测定吸光值。为了更好的实现核酶的类过氧化物酶的活性，更为优选，向50μMhemin工作液中添加1.25μM外引物KMD1-F3和KMD1-B3，10μM内引物KMD1-FIP和KMD1-BIP，40℃孵育30min，然后添加36mMABTS显色液和60mMH2O2，立即判定颜色，测定OD419。在该体系下进行显色反应，能够保证引物形成稳定的G4结构，与hemin最大程度结合，展现出更好的类过氧化物酶活性，在过氧化氢存在的条件下，最大程度的氧化ABTS底物。作为优选，步骤(3)中，向显色反应混合液中添加1.4～2.0mMdNTP、3～8mMMgSO4、0.6～0.8M甜菜碱、3.6～10.0UBstDNA聚合酶大片段、1xThermopolbuffer，2μL样品基因组模板，在60～65℃反应40～60min。反应所使用的仪器为水浴锅或金属浴。为了更好的实现后续环介导等温扩增，更为优选，向显色反应混合液中添加1.6mMdNTP、6mMMgSO4、0.8M甜菜碱，8.0UBstDNA聚合酶、1xThermopolbuffer。扩增反应程序：65℃反应40min，终止反应。在该体系下进行能够保证引物的扩增效率不受影响，在短时间内实现快速扩增，保证尽可能多的核酶引物形成双链产物，从而失去类过氧化物酶活性，使得反应体系消光。进一步地，hemin工作液由hemin溶于工作液配制，hemin的终浓度为40～60μM，优选50μM。ABTS显色液是由ABTS粉剂溶于1XDMSO缓冲液配制，ABTS的终浓度为30～40mM，优选36mM，且现用现配。进一步地，所述工作液含有10mMNaH2PO4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003％(w/w)TritonX-100，由ddH2O配置。第三方面，本专利技术提供了一种环介导等温扩增消光技术检测转基因水稻KMD1的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物，工作液，hemin，ABTS粉剂，DMSO缓冲液，30％(w/w)H2O2，以及1xThermopolbuffer、dNTP、MgSO4、甜菜碱组成的反应液和BstDNA聚合酶；所述工作液含有10mMNaH2PO4、100mMKCl、2mMMgCl2以及0.003％TritonX-100。作为优选，所述反应液是由体积比为5:8:1:10的1xThermopolbuffer、1.4～2.0mMdNTP、3～8mMMgSO4和0.6～0.8M甜菜碱组成。在所述试剂盒中，所述引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中含有1.25μM的KMD1-F3和KMD1-B3与10μM的KMD1-FIP本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于环介导等温扩增消光技术的转基因水稻KMD1检测引物，其特征在于，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物，序列分别为：上游外引物KMD1‑F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGCGGCGATGGCGATGC；下游外引物KMD1‑B3：CTGGGAGGGAGGGAGGGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT；上游内引物KMD1‑FIP：TATCCCGAGATGGGCAGGCACTGGGAGGGAGGGAGGGCCAACTGCGGCGGGT；下游内引物KMD1‑BIP：TTGTGGTGTAAACAAATTGACGCCTGGGAGGGAGGGAGGGGAAAAGAAAAACCACCCCAGTAC。
【技术特征摘要】
1.基于环介导等温扩增消光技术的转基因水稻KMD1检测引物，其特征在于，所述引物包括上游外引物、下游外引物、上游内引物和下游内引物，序列分别为：上游外引物KMD1-F3：CTGGGAGGGAGGGAGGGCGGCGATGGCGATGC；下游外引物KMD1-B3：CTGGGAGGGAGGGAGGGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT；上游内引物KMD1-FIP：TATCCCGAGATGGGCAGGCACTGGGAGGGAGGGAGGGCCAACTGCGGCGGGT；下游内引物KMD1-BIP：TTGTGGTGTAAACAAATTGACGCCTGGGAGGGAGGGAGGGGAAAAGAAAAACCACCCCAGTAC。2.一种检测转基因水稻KMD1的方法，其特征在于，利用环介导等温扩增消光技术用权利要求1所述的引物对样品的DNA进行扩增，通过检测是否有扩增产物来判断是否存在转基因水稻KMD1。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样品基因组模板；(2)显色反应：将hemin工作液与权利要求1所述引物混合，在35～45℃条件下孵育20～30min，添加ABTS显色液和H2O2后得到显色反应混合液，立刻判定颜色或通过紫外分光光度计在419nm处测定吸光值；(3)环介导等温扩增消光反应：向显色反应混合液中添加样品基因组模板，在60～65℃进行环介导等温扩增消光反应40～60min；(4)产物检测：目视判定反应颜色，或通过紫外分光光度计在419nm处测定吸光值，通过与步骤(2)的结果比较，判断是否有扩增产物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将40～60μM的hemin工作液与1.25μM的KMD1-F3和KMD1-B3以及10μM的KMD1-FIP和KMD1-...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄昆仑，许文涛，徐瑗聪，王晨光，罗云波，张莉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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