本发明专利技术涉及猪粪便污染物检测领域，尤其涉及一种指示猪粪便污染的猪‑肠道微生物特异性互作基因1‑38及其应用。一种指示猪粪便污染的猪‑肠道微生物特异性互作基因1‑38，该基因的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术采用竞争性杂交基因片段富集方法（GFE）富集猪特异性宏基因组，构建宏基因文库，对文库进行序列菌群及功能分类，从而靶向筛选了宿主（猪）‑肠道微生物互作靶点有关特异性基因，并针对猪特异性互作基因设计分子标记，建立了灵敏度高、特异性强并能高效指示粪便污染源的监测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猪粪便污染物检测领域，尤其涉及一种指示猪粪便污染的猪-肠道微生物特异性互作基因1-38及其应用。
技术介绍
猪肉制品作为深受国内消费者喜爱的肉制品之一，其庞大的需求量导致生猪产业迅猛发展。据农业部统计，我国生猪出栏量近年来一直占世界第一，占比维持在56％左右，并保持增长态势。由于缺乏对迅猛发展的集约化畜禽养殖业排放的有效管理，猪等畜禽粪便及其污水多以非点源的方式进入环境，引发污染并诱发健康威胁。猪粪便排泄物中不仅含有大量的病原微生物菌(戊型肝炎病毒、沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)、空肠弯曲菌(Campylobacterspp.)，直接威胁到人类健康，而且含有氮，磷等物质，未经有效处理任意排放，会造成土壤，地下水，地表水及灌溉水的污染，并使水体富营养化，进而导致水产品蓄积大量的有害物质，影响水产品品质。因此，建立一种灵敏度高、特异性强并能高效指示粪便污染源的监测方法显得尤为迫切。有研究从宿主粪便源菌群如厚壁菌门(Frimicutes)、双歧杆菌属(Bifidobacteriaspp)、史氏产甲烷杆菌(Methanobrevibactersmithii)等的16SrRNA和毒力基因等筛选标签来判别污染来源。目前已鉴定的猪特异性分子标记大多基于猪肠道优势菌16SrRNA的保守区。也有从粪便中线粒体DNA、大肠埃希菌中筛选毒力基因[来判断猪粪便污染来源。然而，尽管上述特异性分子标记具有一定的特异性和灵敏性，但存在较大的局限性：1)宿主特异性不够高，2)不同宿主间存在交叉反应性，3)有地理地域差异性，4)判别动物来源的精确性不够高，因此会带来较高的错判率。肠道微生物群落与其宿主是共同进化的，经宿主和肠道微生物之间强烈选择和协同进化可形成宿主-微生物相互作用的对宿主有益的功能保留区(互作靶点)，这些互作靶点是形成肠道微生物多样性及特异性的重要因素。因此越来越多的研究从人、牛、鸡等的肠道微生物群落中筛选宿主-微生物互作基因作为宿主特异性分子标记，并证明此类分子标记具有较高的特异性和灵敏性。然而，目前尚未见以宿主-微生物互作基因作为特异性分子标记进行水体或食品中猪粪便非点源污染示踪的相关研究。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的一个目的是提供一种指示猪粪便污染的猪-肠道微生物特异性互作基因1-38，本专利技术的另外一个目的是提供上述的基因的应用，本专利技术针对猪特异性互作基因设计分子标记，建立了灵敏度高、特异性强并能高效指示粪便污染源的监测方法。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：一种指示猪粪便污染的猪-肠道微生物特异性互作基因1-38，该基因的序列如SEQIDNO：1所示。为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：上述的SEQIDNO：1所示的基因用于猪粪便污染检测的特异性互作靶点分子标记的引物和探针。一种基于宿主-肠道微生物互作基因的猪粪便污染检测方法，该方法以上述的SEQIDNO：1所示的基因设计分子标记的引物和探针，采用荧光PCR进行检测。本专利技术采用竞争性杂交基因片段富集方法(GFE)富集猪特异性宏基因组，构建宏基因文库，对文库进行序列菌群及功能分类，从而靶向筛选了宿主(猪)-肠道微生物互作靶点有关特异性基因，并针对猪特异性互作基因设计分子标记，建立了灵敏度高、特异性强并能高效指示粪便污染源的监测方法。附图说明图1为分子标记1-38荧光PCR检测图谱。图2为分子标记3-53荧光PCR检测图谱。图3为分子标记1-38荧光PCR体系的标准曲线及扩增效率图。图4为分子标记3-53荧光PCR体系的标准曲线及扩增效率图。图5为分子标记1-38荧光PCR批间稳定性试验图。图6为分子标记3-53荧光PCR批间稳定性试验图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做一个详细的说明。实施例1特异性猪-肠道微生物互作基因的富集筛选1.1共采集6个物种145个粪便样品，其中包括猪粪便样品34个、奶牛牛粪便样品20份、山羊粪便样品12份、绵羊粪便样品8份，鸡粪便样品7份、鸭粪便样品20份、鹅粪便样品5份和人粪便样品13份。将样品置于无菌容器中，每200mg(湿重)样品中加入3mLGITC缓冲液(5M异硫氰酸胍、100MmEDTA(pH8.0)、十二烷基肌氨酸钠)，低温保存。粪样DNA的提取按FastDNAStoolKit(Qiagen，Valencia，CA)说明书进行。并在紫外分光光度计NanoDropND-2000UV上测定其浓度和纯度(NanoDropTechnologies，Thermofisher)。1.2宿主(猪)特异性基因组富集(GFE)将所有单个猪源样品基因组DNA混合形成基因组混合库以增加基因组的多样性(待富集组)，以牛、羊、鸡、鸭、鹅等其它物种样品基因组混合库作为对照组。1.2.1富集组DNA的准备将待富集组又分为两个组(待富集组A和B)。A组DNA的准备：将DNA声波震荡裂解后以KlenowI聚合酶标记上K9标签；被K9标签标记的DNA片段用MultiwellPCRPurificationKit(Qiagen，Valencia，CA)纯化并扩增以获得足够量的带有K9随机引物的DNA片段。B组DNA的准备(生物素标记DNA片段)：将DNA经声波降解后标记生物素(PAB，Sigma-Aldrich，Atlanta，GA)。1.2.2DNA预杂交及竞争性杂交将待富集组B与对照组DNA分别变性后进行预杂交，随后将此预杂交混合液与A组猪源DNA竞争性杂交后，形成各种组合的DNA双链。经生物素-链亲和素(Streptavidin)酶联免疫吸附捕获试验，将标记有生物素的杂交双链DNA(即至少含一条待富集组单链的双链DNA)捕获并扩增富集。终将获得高丰度的猪源特异性粪样基因组DNA样品。1.3构建宏基因组文库将上述富集过程中每一轮的PCR产物经MultiwellPCRPurificationKit(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照pCRTOPO4.0(Invitrogen)说明书将PCR纯化产物克隆至载体，并转入感受态大肠杆菌DH5α中。阳性克隆用含有有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基筛选获得，鉴定后随机挑选500个重组菌送上海生工股份有限公司进行测序。利用DNAstar对每轮所得序列进行拼接、筛选出382条猪源特异性非冗余序列，以构建宏基因组文库。1.4DNA序列分析在GeneBank数据库中利用BLASTX比对分析，根据相似序列的生物功能对每条非冗余序列进行蛋白质功能预测，其中E值≤10-3，识别率≥30％的序列被认为是相似蛋白序列。通过蛋白相邻类聚簇(COG)数据库将所得DNA序列进行功能基因分类。根据在GeneBank数据库BLASTX比对的结果(最小E值)对富集的非冗余序列进行菌群分类。最终筛选出60条与信息贮存与加工、细胞信息传导和代谢有关基因等可能的猪特异性互作靶点。1.5猪-微生物特异性互作基因的鉴定分别针对60条可能的特异性互作靶点设计引物进行鉴定，结果表明其中基因1-38和基因3-53具有猪源特异性，而不能扩增其它物种的粪便DNA。基因1-38：AAATACTAATGGATAAAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种指示猪粪便污染的猪‑肠道微生物特异性互作1‑38基因，其特征在于：该基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种指示猪粪便污染的猪-肠道微生物特异性互作1-38基因，其特征在于：该基因的序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的基因用于猪粪便污染检测的特异性互作靶点...
【专利技术属性】
技术研发人员：帅江冰，张晓峰，莫虹斐，曾若雪，何永强，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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