一种核酸的扩增方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种核酸的扩增方法及应用。本发明专利技术提供的方法先对待测物进行RPA预扩增，然后再进行LAMP扩增，从而能够在恒温条件下对待测物放大后进行多重检测，检测的灵敏度较高。实验表明，采用本发明专利技术提供的方法进行扩增，能够同时对10个目的基因进行检测，最低检测限为20copies/μL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种核酸的扩增方法及应用。
技术介绍
重组酶聚合酶扩增法(RPA)是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术；该技术利用重组酶入侵、单链结合蛋白绑定DNA单链和DNA聚合酶扩增代替了传统PCR的热循环解链过程，实现在恒温下的核酸快速扩增。RPA技术只需要一对简单的引物就能实现等温扩增，但是重组酶扩增的产物的量大多不高，很难被检测到。且目前尚未有报道称能够以RPA技术进行多重扩增。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR核酸扩增方法。LAMP作为一种分子生物学检测技术，具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及成本低的特点，已广泛用于临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域。该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，LAMP反应在恒温水浴箱便可完成。每个扩增对象需要6条引物才能实现扩增，体系比较复杂，因此无法在一个体系中实现对多个扩增对象的同时扩增或多重的环介导等温扩增。并且，在实际研发实验过程中发现在样本含量极低的领域，LAMP技术的灵敏度无法达到检测要求，上述两种方法都不能够同时对多个检测对象进行检测，而在目前的临床检测中，对高通量检测的要求越来越高，如果能够在恒温条件下实现对待测样品的多重检测，将大幅提高临床的检测效率，且降低对检测条件的要求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种核酸的扩增方法及应用，本专利技术提供的方法能够实现恒温条件下对待测样品进行多重扩增，提高灵敏度。本专利技术提供的核酸的扩增方法为，待测样品经RPA预扩增后，进行LAMP扩增；其中RPA预扩增为多重扩增或单重扩增，LAMP扩增为单重扩增。RPA预扩增使用的扩增引物为后续LAMP对应的引物。本专利技术通过RPA预扩增对待测样品中的DNA进行富集。本专利技术所述的单重扩增是指对某一特定基因片段进行扩增的过程。多重扩增则是至对多个目的基因在同一反应体系中进行扩增的过程。RPA预扩增可采用单重扩增，也可采用多重扩增。为了能够实现对目的基因的高通量检测，RPA预扩增优选采用多重扩增。样品经RPA预扩增后，获得预扩增产物，将预扩增体系进行分装，然后在分装后的体系中，分别针对不同的目的基因进行LAMP扩增。并且，RPA扩增后产物的检测往往只能使用电泳法，这就为快速简便的检测带来了操作上的困难，本专利技术在RPA之后进行LAMP扩增，是检测结果能够通过颜色反应进行判别，从而能够实现检测结果判别的可视化。本专利技术采用的RPA预扩增的体系中包括：RPA预扩增引物、待测样品、SSB蛋白、UvsX蛋白、UvsY蛋白、DNA聚合酶和反应缓冲液。本专利技术中，RPA预扩增的引物为LAMP扩增引物中的F3、B3。RPA预扩增的目的是对目的基因的含量进行富集，其引物可以单独设计也可使用LAMP扩增引物中的外引物对其进行扩增。如单独设计，其扩增所得片段应包括以F3、B3为引物扩增得到的片段。为避免引入新的引物对后续LAMP扩增产生未知干扰，本专利技术以LAMP扩增引物中的F3、B3作为RPA预扩增的引物。并且，多重RPA使用的引物与后续LAMP部分引物一致，也解决了RPA本身要求的引物过长(30bp～35bp)不方便设计、容易形成自身二级结构等的缺陷。我们引入RPA技术在LAMP检测前进行多重指标一管内的预扩增，并且多重引物使用的是LAMP引物对中的F3、B3引物，有效的避免引入新的引物干扰后续LAMP反应的风险。RPA技术要求引物的长度在30bp～35bp，实际我们所使用的F3、B3引物只有20bp左右，降低了过长引物容易产生二级结构等干扰扩增的风险。本专利技术提供的方法不仅适用于样本中普通待测物的检测，更加适合待测物含量较低的样品。例如，菌血症患者血液内细菌的含量较低、或者一些需要检测脑脊液的患者，其脑脊液中菌类的含量也极低。这种情况下，普通的LAMP技术或RPA技术无法完成快速准确的检测。临床中常需进行检测的标本为脑脊液或血液。本专利技术所述的待测样品为脑脊液的cDNA或血液的cDNA。由于脑脊液中基因的表达量都不高，还有一些特殊的基因在血液中的表达量也非常低，普通的LAMP技术的灵敏度不足，很难通过直接进行LAMP的方法检测到这些目的基因。对待测样品进行RPA预扩增后，目的基因的量得到了富集，从而使得通过LAMP技术对其进行检测的技术得以实施。所述SSB蛋白、UvsX蛋白、UvsY蛋白、DNA聚合酶的质量比为800:60:50：50。所述SSB蛋白在反应体系中的浓度为800ng/μL；所述UvsX蛋白在反应体系中的浓度为60ng/μL；所述UvsY蛋白在反应体系中的浓度为50ng/μL；所述DNA聚合酶在反应体系中的浓度为50ng/μL。所述反应缓冲液中包括：Tris、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶、磷酸肌酸和RecQ蛋白。反应缓冲液中各组分的浓度为：一些实施例中，各组分的浓度为：Tris50mM醋酸钾50mM醋酸镁10mM二硫苏糖醇6.25mM聚乙二醇7.5％(w/v)ATP7.5mMdNTPs1.5mM肌酸激酶3.5μg/U磷酸肌酸37.5mMRecQ蛋白10ng/μL作为优选，RPA反应体系的体系为9.5μL；其中：RPA反应以镁离子启动反应。作为优选，镁离子来自醋酸镁。醋酸镁的浓度为280mM，加入反应体系的体积为0.5μL。本专利技术中，RPA预扩增的温度为37℃～42℃，时间为15min～40min。一些实施例中，RPA预扩增的温度为37℃，15min。实验表明，37℃，15min的扩增所得产物的浓度便足以进行LAMP扩增。以本专利技术提供的RPA反应体系和RPA反应条件进行扩增，能够获得足够量的预扩增产物，所述预扩增产物可用于LAMP扩增。优选的，本专利技术所述的RPA预扩增为多重扩增，所述多重扩增为2～10重扩增。经实验表明，RPA预扩增最多能够实现10重的稳定扩增，即在同一体系中，实现对10个目的基因的同时扩增，扩增结果特异性良好。本专利技术所述的LAMP扩增的体系中包括：RPA预扩增的产物、LAMP扩增引物、反应缓冲液、BstDNA聚合酶、甜菜碱、染料、Mg2+和BSA。所述Mg2+的来源为硫酸镁。所述反应缓冲液为ThermoPolBuffer；优选为10×ThermoPolBuffer。所述染料为EvaGreen、SYBRgreenI或钙黄绿素。本专利技术中采用的染料为EvaGreen，优选为20×的EvaGreen。LAMP扩增体系中各组分的加入量为：RPA预扩增的产物5μL10×ThermoPolBuffer5.5μL甜菜碱8.7μLBSA0.5μLMgSO40.5μL20×EvaGreen1.6μLBstDNA聚合酶2.2μLLAMP引物组1.09μLLAMP扩增体系中，甜菜碱的浓度为5mol/L；BSA的浓度为50mg/mL；MgSO4的浓度为400mmo/L；BstDNA聚合酶的浓度为8U/μL。LAMP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸的扩增方法，其特征在于，待测样品经RPA预扩增后，进行LAMP扩增；所述RPA预扩增为单重扩增或多重扩增，所述LAMP扩增为单重扩增。

【技术特征摘要】
1.一种核酸的扩增方法，其特征在于，待测样品经RPA预扩增后，进行LAMP扩增；所述RPA预扩增为单重扩增或多重扩增，所述LAMP扩增为单重扩增。2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述RPA预扩增的体系中包括：RPA预扩增引物、待测样品、SSB蛋白、UvsX蛋白、UvsY蛋白、DNA聚合酶和反应缓冲液。3.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述RPA预扩增的引物为LAMP扩增引物中的F3、B3。4.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述RPA预扩增的温度为37℃～42℃，时间为15min～40min。5.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述LAMP扩增的体系中包括：所述RPA预扩增的产物、LAMP扩增引物、反应缓冲液、BstDNA聚合酶、甜菜碱、染料、Mg2+和BSA。6.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述L...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，盖伟，邢婉丽，冀元凯，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11