一种快速有效鉴别存活精子的方法技术

本发明专利技术公开一种快速有效鉴别存活精子的方法：应用非接触性的1.48μm波长的二极管激光直接射击不动精子的尾端时，存活的精子发生明显的卷尾现象，而死亡精子无此现象。1.48μm激光远离DNA吸收峰0.26μm。精子选择所用的激光能量远远小于透明带操作，其产生的损伤区域更小，为1‑1.2μm，射击精子的尾端不会损伤到头部的DNA，即使多次射击人精子头部未增加DNA碎片。该发明专利技术应用激光选择不动但存活精子行ICSI是可行的。本发明专利技术应用激光选择存活精子进行ICSI，具有不需与精子直接接触、无需使用化学试剂、操作简便、快速等优点，能确保在最短的时间内迅速选择有活力的精子进行ICSI，从而为提高辅助生殖技术的有效性提供了新方法，且国内未见相关的研究报道。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鉴别精子的方法，尤其是一种快速有效鉴别存活精子的方法。
技术介绍
卵胞浆内单精子注射(Intracytoplasmicsperminjection，ICSI)技术是目前严重男性因素不育患者获得自身遗传学后代最有效的方法。经过20多年的发展，目前ICSI技术主要应用于严重少、弱、畸形精子症，圆头(顶体缺乏)精子或完全不动精子，不可逆的梗阻性无精症，前次体外受精失败以及胚胎植入前遗传学诊断患者。众所周知，ICSI的先决条件是要有活精子注射到卵母细胞内激活卵子，进而完成受精和后续胚胎发育。精子的运动性是其具有生命力的标志，然而，胚胎学家发现，一些严重少、弱、畸形精子症，睾丸手术取精以及精子鞭毛不动症患者获取的精子运动性很差，甚至完全不动。在梗阻性无精子症中，90％的睾丸精子是有活力的，但其活动力极其微弱甚至完全不动；精子鞭毛不动症(Immotileciliasyndrome，ICS)是常染色体隐性遗传病，是由于纤毛细胞纤毛超微结构的缺陷引起，在新生儿中占0.005％；男性ICS患者精子鞭毛超微结构缺陷引起严重弱精子症或完全不动精子症，从而导致不育。研究证实，用不动精子行ICSI后的受精率往往较低，其主要原因是精子已经死亡、精子尾部的微管畸形或存在其它超微结构的异常，以及精子在附睾转运和/或贮存过程中发生降解；死精子的DNA已发生解体，即使注入卵母细胞后也无法激活卵子而受精，因此，使用不动精子行ICSI带来了正确选择有活性精子的难度，对操作人员的经验要求更大，不同操作人员由于对有活性精子选择经验的不同，将明显影响受精率。如何建立一种快速简便的筛选存活但不动精子的方法，及时在卵母细胞最佳受精“窗口”内进行ICSI以避免卵子过度老化而影响体外受精-胚胎移植结局尤为重要。精子膜完整性与精子代谢、顶体反应、精子获能及精卵融合密切相关。此外，精子膜功能完整性还与受精卵着床、胚胎植入密切相关；精子尾部细胞膜属于半透膜，具有自动调节膜内外渗透压平衡的能力；激光具有热效应，当低能量激光射击活动精子尾部时，由于局部温度升高很可能发生蛋白质变性而导致精子尾部细胞膜的流动性、通透性改变。当激光照射精子尾膜时，热效应使精子尾膜内外的渗透压不平衡，活精子的细胞膜处于完整的状态，具备调节细胞膜内外渗透压平衡的能力，水分子可由膜外进入膜内；而死精子尾膜的通透性发生改变，丧失调节膜内外渗透压的能力，水分子无法进入膜内。激光的这一特性为胚胎学家从完全不动精子中鉴别有活力精子用于ICSI提供了新思路。研究已经证实，应用激光的热效应可以直接对活动精子进行制动，将制动后的精子用于ICSI已经获得了健康的婴儿。激光选择精子的方法具有精确控制、操作简便、快速等特点，近年来在医学研究和临床实践中应用广泛。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速有效鉴别存活精子的方法。这种快速有效鉴别存活精子的方法：应用非接触性的1.48μm波长的二极管激光直接射击不动精子的尾端时，存活的精子发生明显的卷尾现象，而死亡精子无此现象。激光使用的是红外线作用模式，不会产生紫外线危害。1.48μm激光远离DNA吸收峰0.26μm。精子选择所用的激光能量远远小于透明带操作，其产生的损伤区域更小，为1-1.2μm，射击精子的尾端不会损伤到头部的DNA，即使多次射击人精子头部未增加DNA碎片。快速有效鉴别存活精子的方法，具体由以下步骤组成：①将获取的不动精子离心处理后，加入到Quinn’s-1020操作皿中；②在视野下选择形态较好的精子；③在精子尾部靠近尾巴尖端处，用2ms的激光能量射击；④如果激光射击后，精子尾部立即出现明显的卷尾现象，则判定为存活精子，对激光射击无反应、不发生卷尾的为死精子。专利技术的有益效果：该专利技术应用激光选择不动但存活精子行ICSI是可行的。传统的伊红染色是鉴别精子活力的标准方法，但是经伊红染色后鉴别出的活精子无法再用于受精，低渗肿胀法比较耗时、操作繁琐、且各实验室间的操作方法各有不同，并且需要有经验的胚胎学家操作。本专利技术应用激光选择存活精子进行ICSI，具有不需与精子直接接触、无需使用化学试剂、操作简便、快速等优点，能确保在最短的时间内迅速选择有活力的精子进行ICSI，从而为提高辅助生殖技术的有效性提供了新方法，且国内未见相关的研究报道。具体实施方式实施例：(一)基础：使用激光制动精子进行ICSI的安全性。研究证实：使用1.48μm二极管激光选择精子行ICSI被认为是安全的。激光使用的是红外线作用模式，不会产生紫外线危害，且1.48μm激光仍远离DNA吸收峰(0.26μm)。选择精子所用的激光能量远远小于透明带操作，其产生的损伤区域更小(约1μm)，射击精子的尾端不会损伤到头部的DNA；更有研究表明即使多次射击人精子头部也未增加DNA碎片。因此，采用非接触二极管激光进行精于制动是安全有效的。(二)突破性发现：既然激光射击活动精子的尾部可以导致尾部细胞膜通透性改变，我们提出假设：当激光射击不动精子的尾部时，活精子和死精子的降呈现什么特点？通过试验我们发现，应用非接触性的1.48μm波长的二极管激光直接射击不动精子的尾端时，存活的精子发生明显的卷尾现象，而死亡精子无此现象。随后我们用WHO第五版人类精液检查与处理操作手册中推荐的鉴别存活精于的“金标准”-伊红染色法进行验证，证实了激光法鉴别存活但不动精子的有效性。此外，用激光选择精子的时其细胞膜的流动性和通透性发生改变，引起细胞内钙离子浓度的改变，有利于受精。(三)方法与临床应用将获取的不动精子离心处理后，加入到Quinn’s-1020操作皿中，在视野下选择形态较好的精子，在精子尾部靠近尾巴尖端处，用2ms的激光能量射击，如果激光射击后，精子尾部立即出现明显的卷尾现象，则判定为存活精子，对激光射击无反应不发生卷尾的为死精子。我们将这种方法应用到了两例实验上：其一，于取卵日，经附睾穿刺未找到精子，后改行睾丸穿刺取精。将睾丸组织刮碎后镜检，每个视野可见1～2条不动精子，培养3～4小时后，仍未找到活动精子。为防止卵子老化，应用激光选择存活的精子行ICSI。其二，经多次精液检查均显示：精子活动率均为0％，正常形态率为0.5～0.8％。取卵当天精液常规分析：精子活动率仍为0％，故直接应用激光选择存活的精子行ICSI。ICSI后第二天观察受精情况，第一例的受精率为83.33％，第二例为100％。两例获得的胚胎培养至第3天时分别移植到相应子宫内。移植28天后经B超诊断，两例均成功获得了临床妊娠。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速有效鉴别存活精子的方法，其特征是：应用非接触性的1.48μm波长的二极管激光直接射击不动精子的尾端时，存活的精子发生明显的卷尾现象，而死亡精子无此现象。

【技术特征摘要】
1.一种快速有效鉴别存活精子的方法，其特征是：应用非接触性的1.48μm波长的二极管激光直接射击不动精子的尾端时，存活的精子发生明显的卷尾现象，而死亡精子无此现象。2.根据权利要求1所述的一种快速有效鉴别存活精子的方法，其特征在于：所述的激光使用的是红外线作用模式，不会产生紫外线危害。3.根据权利要求1所述的一种快速有效鉴别存活精子的方法，其特征在于：所述的1.48μm激光远离DNA吸收峰0.26μm。4.根据权利要求1所述的一种快速有效鉴别存活精子的方法，其特征在于：所述的精子选择所用的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯贵雪，陈焕华，张波，周红，汪彩珠，舒金辉，甘贤优，
申请(专利权)人：冯贵雪，广西壮族自治区妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：广西;45