一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液及其配制方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体是涉及一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液及其配制方法。具体是在平衡液‑磷酸盐缓冲液（1×PBS）中特异性添加杆状病毒合成E2蛋白的限制性氨基酸、硫酸葡聚糖钠盐及聚醚F‑68，作为维持液用于替代昆虫细胞接种重组杆状病毒的细胞培养基。在相同的培养条件、细胞数量及接毒量下，与昆虫细胞培养基相比，本发明专利技术提高了单位数量细胞感染、生产重组杆状病毒量及分泌E2重组蛋白含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体是涉及一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液及其配制方法。
技术介绍
杆状病毒表达系统可为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白，所以利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统重组蛋白是亚单位疫苗研发的重要方向之一。但是，由于昆虫细胞培养基价格昂贵，重组蛋白表达量较低，导致很多重组杆状病毒亚单位疫苗停步于实验室研发阶段。常规的昆虫细胞-杆状病毒表达系统接毒方法是，当昆虫细胞生长到一定密度，活率不低于95％时，用昆虫细胞培养基调整细胞密度，补充体系养分后接种杆状病毒。商品化的无血清昆虫细胞培养基价格昂贵，pH值介于6.10-6.40，渗透压介于350-380mOsm/kg。此方法未考虑接毒后细胞生长需求及病毒复制的限制性因素，不仅影响猪瘟病毒E2重组蛋白的表达，而且单位体积抗原生产成本高。目前研究表明，其原因可能是，一、随着昆虫细胞的增殖，对能量、限制性氨基酸需求量加大，同时细胞代谢物大量积累(乳酸、丙氨酸、尿酸、NH4+等)，培养液的pH、渗透压相应发生改变，极大地影响昆虫细胞生长及接毒后病毒的增殖。细胞培养体系缺少谷氨酰胺时会影响细胞合成核酸、蛋白质，以致影响细胞生长。但溶液中不稳定的谷氨酰胺会对培养的细胞产生有害影响，丙氨酰谷氨酰胺(丙谷二肽，Ala-Gln)是一种二肽，稳定性好，在培养基中可有效替代谷氨酰胺，促进细胞生长。KennieU.Dee等报道昆虫细胞培养过程中培养基提供的葡萄糖能够满足需求，而天冬氨酸消耗较多，是细胞生长的制约因素之一。二、重组杆状病毒感染昆虫细胞早期表现为细胞直径增大，细胞核变大；晚期表现为细胞停止生长，病毒出芽，部分细胞凋亡，感染末期细胞裂解。感染晚期为重组蛋白的最佳收获期。病毒利用宿主细胞合成自身蛋白过程中，可能因体系氨基酸等养分的缺失影响病毒的增殖、复制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供了一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液及其配制方法，用于昆虫细胞接种重组杆状病毒后调节体系组分，补充养分，以维持细胞生长，促进重组杆状病毒的增殖及猪瘟病毒E2重组蛋白的分泌量，同时降低表达成本。本专利技术的的技术方案：一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液，所述昆虫细胞维持液是由在1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液中添加限制性氨基酸、硫酸葡聚糖钠盐及聚醚F-68组成。进一步，所述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液是由氯化钠6000-10000mg/L、氯化钾100-300mg/L、磷酸氢二钠1000-2000mg/L、磷酸二氢钾100-400mg/L及余量的浓盐酸组成，所述余量的浓盐酸是指将上述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液的pH值调整为6.40的使用量。更进一步，所述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液是由氯化钠8000mg/L、氯化钾200mg/L、磷酸氢二钠1440mg/L、磷酸二氢钾240mg/L及余量的浓盐酸组成，所述余量的浓盐酸是指将上述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液的pH值调整为6.40的使用量。进一步，所述的限制性氨基酸是指在甘氨酸、DL-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺及丙谷二肽。再进一步，所述的甘氨酸20-40mg/L、DL-苏氨酸80-105mg/L、L-缬氨酸80-105mg/L、L-亮氨酸90-150mg/L、L-天冬氨酸20-40mg/L、L-天冬酰胺30-70mg/L、丙谷二肽150-450mg/L。更进一步，所述的甘氨酸30mg/L、DL-苏氨酸95mg/L、L-缬氨酸94mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-天冬氨酸30mg/L、L-天冬酰胺50mg/L及丙谷二肽300mg/L。进一步，所述的硫酸葡聚糖钠80-120mg/L；所述聚醚F-68为800-1200mg/L。更进一步，所述硫酸葡聚糖钠100mg/L；所述聚醚F-68为1000mg/L。配制上述昆虫细胞维持液的方法：用去离子水配制1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液，滴加浓盐酸将pH调节至6.40后；向上述平衡液-磷酸盐缓冲液中添加甘氨酸、DL-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、丙谷二肽、硫酸葡聚糖钠及聚醚F-68，充分溶解后用0.22μm的除菌过滤器过滤；最后，无菌检验合格，渗透压在350-380mOsm/kg的溶液即可作为昆虫细胞维持液。有益效果：本专利技术根据遗传算法，分析了构成猪瘟病毒E2蛋白的373个氨基酸，其中氨基酸数最多的为缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸，是重组杆状病毒合成E2重组蛋白的限制性氨基酸。其中，硫酸葡聚糖钠盐可以有效促进昆虫细胞悬浮培养及蛋白的表达；聚醚F-68可保护悬液中的细胞免受转移和搅拌造成的损害，在发酵罐中进行大批量细胞培养时，可以防止空气粘附于细胞，稳定细胞表面泡沫来提高细胞膜对水动力剪切的抵抗力。本专利技术在平衡液-磷酸盐缓冲液(1×PBS)中特异性添加杆状病毒合成E2蛋白的限制性氨基酸、硫酸葡聚糖钠盐及聚醚F-68，作为维持液用于替代昆虫细胞接种重组杆状病毒的细胞培养基。在相同的培养条件、细胞数量及接毒量下，与昆虫细胞培养基相比，本专利技术显著提高了单位数量细胞感染、生产重组杆状病毒量及分泌E2重组蛋白含量，很大程度上降低了生产成本。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术作进一步说明，但不作为对本专利技术的限定。实施例1、用生物学软件DNAman分析重组在杆状病毒上的猪瘟病毒E2基因序列(1119bp)及其编码的氨基酸序列(373aa)，比较了序列的氨基酸组分，预测该蛋白的等电点为5.93，结果见表1。基于遗传算法预测该蛋白合成的主要限制性氨基酸是缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸。表1猪瘟病毒E2蛋白氨基酸组分昆虫细胞生长代谢研究结果表明，天冬氨酸随细胞生长而快速消耗；基于实验室对昆虫细胞悬浮培养研究，证实添加聚醚F-68及硫酸葡聚糖钠盐可提高细胞抗剪切力，改善细胞悬浮培养状态。综上，本申请建立了一种用于昆虫细胞接种重组杆状病毒后的细胞维持液配制新方法，在1×PBS平衡液中添加细胞培养保护剂聚醚F-68、硫酸葡聚糖钠盐以及能够提高重组蛋白表达量的特异性氨基酸，具体配制方法如下：根据表2称量下列试剂，用去离子水配制1×PBS平衡液，滴加浓盐酸将pH调节至6.40后定容，备用。表2PBS平衡液配方根据表3称量下列试剂，依次溶解于新鲜配制的1×PBS平衡液(pH＝6.40)中，用0.22μm的除菌过滤器过滤，留样进行无菌检验及渗透压测定。无菌检验合格，渗透压介于350-380mOsm/kg的溶液即可作为昆虫细胞接种杆状病毒后的维持液，用于改善细胞悬浮培养条件，提高猪瘟病毒E2重组蛋白的表达量。表3昆虫细胞接毒维持液配方当昆虫细胞生长至一定密度，加入所需体积的病毒维持液，调整细胞密度接种杆状病毒，在病毒感染高峰期(晚期)，取样进行细胞计数；收获病毒后，检测毒液内猪瘟病毒E2重组蛋白的定量。实践验证，1、Sf9细胞悬浮培养表达E2蛋白Sf-9细胞系源于美国农业部昆虫病理实验室，来源于秋蝇蠕虫(草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液，其特征在于：所述昆虫细胞维持液是由在1×PBS平衡液‑磷酸盐缓冲液中添加限制性氨基酸、硫酸葡聚糖钠盐及聚醚F‑68组成。

【技术特征摘要】
1.一种提高猪瘟病毒E2重组蛋白表达量的昆虫细胞维持液，其特征在于：所述昆虫细胞维持液是由在1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液中添加限制性氨基酸、硫酸葡聚糖钠盐及聚醚F-68组成。2.如权利要求1所述的昆虫细胞维持液，其特征在于：所述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液是由氯化钠6000-10000mg/L、氯化钾100-300mg/L、磷酸氢二钠1000-2000mg/L、磷酸二氢钾100-400mg/L及余量的浓盐酸组成，所述余量的浓盐酸是指将上述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液的pH值调整为6.40的使用量。3.如权利要求2所述的昆虫细胞维持液，其特征在于：所述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液是由氯化钠8000mg/L、氯化钾200mg/L、磷酸氢二钠1440mg/L、磷酸二氢钾240mg/L及余量的浓盐酸组成，所述余量的浓盐酸是指将上述1×PBS平衡液-磷酸盐缓冲液的pH值调整为6.40的使用量。4.如权利要求1所述的昆虫细胞维持液，其特征在于：所述的限制性氨基酸是指甘氨酸、DL-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺及丙谷二肽。5.如权利要求4所述的昆虫细胞维持液，其特征在于：所述甘氨酸20-40mg/L、DL-苏氨酸80-105mg/L、L...

【专利技术属性】
技术研发人员：王遵宝，田晓艳，李俊辉，贺笋，李延涛，薛青红，豆智华，张先锋，郑侃，马兴霞，
申请(专利权)人：天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆;65