本发明专利技术公开了一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的引物，包括引物PEDV‑F、引物PEDV‑R、PCV2‑F和引物PCV2‑R；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术通过对复合PCR反应体系和反应条件的优化，得到的用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法。能够捕获更多信息且快速精确检测出微量核酸，提升了鉴别、检测的敏感性及特异性，能够快速、特异的检测猪流行性腹泻病毒及猪圆环病毒2型，大大提高了这两种病毒的检测效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法及引物。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)冠状病毒，PEDV基因组单股正链的RNA，全长27～33kb。主要经消化道感染能够引起猪病毒性腹泻，多发生于冬、春两季。病猪和带毒猪是主要传染源，病毒随粪便排出后污染周围环境和饲养用具，散播传染。这种急性肠道传染病在临床上的主要特征为体温急剧升高，极度口渴，饮水量增加，不愿采食或停止采食，呕吐，随后剧烈腹泻并迅速脱水。PEDV可以感染各年龄猪，哺乳猪、架子猪或肥育猪的发病率很高，其中对仔猪的危害最大，严重影响饲料转化率，导致大量仔猪死亡。近年来，全国各猪场爆发了严重的猪流行性腹泻疫情。猪圆环病毒2型(PCV2)是圆环病毒科、圆环病毒属的重要成员，基因组为单分环状的单股DNA，大小小于2.5kb。可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道复合体病和繁殖障碍(PRDC)等多种疾病。该病毒是目前发现的一种最小的动物病毒，对猪具有免疫抑制特性。目前，猪PCV2的感染率较高，具有很强的免疫抑制作用，降低了猪对其它病原的抵抗能力，从而引发多种病原的混合感染。综上，两种病毒均对我国养猪业造成了严重的经济损失。均可引起断奶仔猪渐进性消瘦、呼吸困难、腹泻甚至死亡等，且在临床上混合感染率较高。由于分子生物学的不断发展，PCR检测技术因具有操作简便、耗时短、特异性高且结果精确等特点，在日常检测中得到广泛应用。但随着猪场集约化养殖的不断发展，密集型饲养方式以及猪群的跨区域流通导致猪群之间接触的几率增大，导致患病猪群多呈现混合感染现象。因此，建立快速有效检测两种疾病的方法显得十分关键。在以往的疾病检测中，使用传统的单项PCR、PR-PCR检测方法难免费时费力。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对单项PCR、RT-PCR只能分别诊断PCV2、PEDV的问题，提供了一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法及引物，以解决现有技术中缺乏一种能够同时诊断PCV2、PEDV病毒的方法的技术问题。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的引物，包括PEDV引物对和PCV2引物对；PEDV引物对包括引物PEDV-F和引物PEDV-R，所述PCV2引物对包括引物PCV2-F和引物PCV2-R；所述引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本专利技术还公开了一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法，包括以下步骤：用上述的引物、对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测扩增产物；扩增产物大小为530bp，则样本中含有或候选含有猪流行性腹泻病毒；扩增产物大小为278bp，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒2型；本方法用于非诊断和治疗目的。进一步地，复合PCR扩增的退火温度为63℃。进一步地，复合PCR扩增的反应体系为25μL，其中，10×buffer(Mg2+free)2.5μL、dNTPMix2.0μL、MgCl21.5μL、TakaraTaqHs0.2μL、引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R各1.0μL、DNA或cDNA模板1.0μL，其余用ddH2O补足。进一步地，复合PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃30s、63℃30s、72℃30s，共35个循环；72℃延伸7min。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术复合PCR方法是在同一反应体系中加入两对引物对两个目的基因同时进行PCR扩增的实验方法。所以具有省时、省力、降低检测成本、减少样品污染等优点现已发展成一种通用检测技术，并成功用于分子遗传学、疾病诊断、病原鉴别等各个方面。2)本专利技术的复合PCR能够捕获更多信息且快速精确检测出微量核酸，提升了鉴别、检测的敏感性及特异性，能够鉴别诊断PCV2和PEDV病毒。3)本专利技术提供了一种PEDV、PCV2复合PCR检测技术，能够快速、特异的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪圆环病毒2型，大大提高了这两种病毒的检测效率。4)本专利技术设计的特异性引物，以两种病毒的DNA、cDNA作为模板进行复合PCR方法的构建与优化，发现在退火温度为63℃时其扩增效果最好，无任何非特异扩增条带。本专利技术建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)两种疾病的复合PCR检测方法。在对临床样品的检测比较中笔者发现，复合PCR与单项PCR、RT-PCR检测的符合率达到100％且成本更低，方便快捷，具有特异性高、灵敏度强、结果准确的优点。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术单一PCR检测结果；其中，M：DNA分子质量标准；1：PCV2+PEDV；2：PEDV3：PCV2；4：阴性对照；图2是本专利技术不同浓度的dNTPMix的复合PCR扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准；1：dNTPMix1.0μL；2：dNTPMix1.5μL；3：dNTPMix2.0μL；4：dNTPMix2.5μL；5：阴性对照；图3是本专利技术不同浓度的Mg2+的复合PCR扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准；1：Mg2+2.5μL；2：Mg2+2.0μL；3：Mg2+1.5μL；4：Mg2+1.0μL；5：阴性对照；图4是本专利技术不同浓度的TaqHs酶的复合PCR扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准；1：TaqHs0.5μL；2：TaqHs0.4μL；3：TaqHs0.3μL；4：TaqHs0.2μL；5：阴性对照；图5是本专利技术不同退火温度的复合PCR扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准；1：56.6℃；2：57.5℃；3：58.6℃；4：60.0℃；5：61.7℃；6：63.0℃；7：64.2℃；8：65.2℃；9：65.7℃；10：66.0℃；11：阴性对照；图6是本专利技术不同引物浓度的复合PCR扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准；1：PCV20.5μL、PEDV0.5μL；2：PCV20.8μLPEDV0.8μL；3：PCV21.0μL、PEDV1.0μL；4：PCV21.5μL、PEDV1.5μL；5：PCV21.8μL、PEDV1.8μL；6：PCV22.0μL、PEDV2.0μL；7：阴性对照；图7是本专利技术复合PCR的特异性试验；其中，M：DNA分子质量标准；1：PRV；2：PRRSV；3：PPV；4：PCV2；5：PEDV；6：PCV2+PEDV；7：阴性对照；图8是本专利技术复合PCR的重复性试验；其中，M：DNA分子质量标准；1：阴性对照；2、3、4、5：分别为同一模板的5次扩增结果；图9是本专利技术复合PCR的敏感性试验，其中，M：DNA分子质量标准；1-7：模板的稀释度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的复合PCR引物，其特征在于，包括PEDV引物对和PCV2引物对；PEDV引物对包括引物PEDV‑F和引物PEDV‑R，所述PCV2引物对包括引物PCV2‑F和引物PCV2‑R；所述引物PEDV‑F、引物PEDV‑R、引物PCV2‑F和引物PCV2‑R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的复合PCR引物，其特征在于，包括PEDV引物对和PCV2引物对；PEDV引物对包括引物PEDV-F和引物PEDV-R，所述PCV2引物对包括引物PCV2-F和引物PCV2-R；所述引物PEDV-F、引物PEDV-R、引物PCV2-F和引物PCV2-R的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。2.一种用于鉴别诊断PCV2和PEDV病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求1中所述的引物、对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳或测序法检测扩增产物；扩增产物大小为530bp，则样本中含有或候选含有猪流行性腹泻病毒；扩增产物大小为278bp，则样本中含有或候选含有猪圆环病毒2型；本方法用于非...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱玲，龚双燕，徐志文，孙贤刚，李小璟，杨泽晓，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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