基于金磁免疫层析的瘦肉精快速测定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于金磁免疫层析的瘦肉精快速测定方法，包括：纳米金磁颗粒与抗原的结合；试纸条的制备与组装；利用免疫层析试纸条对猪肉中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺进行定量检测，通过磁性阅读仪对试纸条上的磁信号进行采集，可对盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的含量进行定量检测。该检测方法较传统仪器分析方法更为简单快捷，且检测成本较低，有望进行大规模的推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物免疫检测领域，涉及一种通过金磁纳米免疫层析试纸条对肉制品中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的快速检测的快速检测方法。
技术介绍
免疫层析法(Immunochromatography)是20世纪90年代兴起的一种快速诊断技术，通过将免疫标记技术与层析技术结合，利用抗原抗体特异性反应形成免疫复合物，进而对待分析物实现定性/定量检测。免疫分析法主要是基于抗原抗体特异性结合的原理，利用标记示踪物与抗原或抗体形成复合物被截留而显色，由此实现对药物、微生物、蛋白类物质、细胞因子及核酸等微量物质的检测。相较于其它检测技术，具有高度选择性的免疫分析法具有快速、简便、廉价的特点，其专属性强、稳定性好，可满足高通量、低限量样品的初筛检测。免疫分析法作为常规实验室诊断的一次技术革命，自问世以来以其独特的优势而倍受青睐，推动了环境、食品等检测领域以及其它一些尖端科技的发展。目前，免疫层析技术正朝着定量、高灵敏度、多标记检测等方向发展，应用比较广泛的免疫检测技术主要有免疫巧光法、免疫层析法、酶联免疫法等。纳米颗粒作为载体的新型层析技术是近年来研究热点。免疫金标记技术(immunogoldlabelingtechnique)就是利用了纳米的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物而发展起来的。纳米金本身胶体金颗粒具有高电子密度、高蛋白结合能力和易处理的性质，可与目标抗体蛋白通过吸附或共价偶联制备对应的免疫微球，基于局域表面等离子体共振效应以及电磁场耦合效应，标记物在相应的配体处大量聚集时可产生很强的显色反应，因而可用于金属离子、小分子、DNA、蛋白质及肿瘤细胞等目标物的快速免疫检测。但由于免疫胶体金共价偶联抗体只能用于定性或半定量的检测，难以满足检测指标定量化的要求，同时检测结果靠肉眼判断，特别是在检测结果呈弱阳性时，极易造成人为漏检现象，因此存在灵敏度较低等问题。金磁免疫层析技术结合了磁学、光学和免疫层析的优势，以纳米金磁复合微粒代替胶体金作为标记材料，利用磁性定量的特点弥补了胶体金标记免疫层析技术不能定量检测等缺陷。利用纳米金磁颗粒高特异性识别、高亲和吸附特点，免疫磁分离结合胶体金免疫层析技术能够将靶分子从成分复杂的生物体系中分离出来起到样品的浓缩作用，从而大大提高了检测的灵敏度和检出率。金磁免疫层析技术是免疫层析技术发展过程的一次飞跃，也是对磁性免疫层析技术的继承和发展，同时也充分体现了传统胶体金标记免疫层析技术操作简单、价格低廉等优点，拥有传统标记物所无法比拟的优势。目前，将金磁复合微粒用于免疫层析的相关研究已有报道，磁微粒利用已知的方法耦合到目标微粒，从而提供磁样品元件或磁耦合混合物。定量测量耦合到磁微粒的目标微粒以形成磁耦合复合样品的方法实现对目标物的检测，然而其用于瘦肉精中的定量检测尚鲜见报道。瘦肉精作为一种人工合成的β2-肾上腺素受体激动剂，在显著提高瘦肉率的同时也造成动物源性食品中瘦肉精的残留问题。有效的检测方法是控制瘦肉精滥用的关键之一，因此有必要研发高灵敏的快速检测方法。目前，盐酸克伦特罗的常用检测方法主要有色谱方法、免疫学方法、电化学方法和传感器法等。传统的仪器分析方法由于样品前处理时间长、仪器设备昂贵、检测成本高、对技术人员的要求高等缺点，很难实现对样品中残留物的实时监测。以胶体金标记免疫分析为代表的新型标记免疫测定技术及由此衍生的实验方法以其特异灵敏、快速准确、操作简便、廉价高效、前处理简单以及无需特殊检测设备等优点成为兽药残留检测的重要工具，有些已在免疫学检验中得到了广泛的应用，有些尚处于研究和探索阶段。基于以上原因，本专利技术因此而来。
技术实现思路
本申请旨在提供一种通过金磁纳米免疫层析试纸条对肉制品中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的快速检测的快速检测方法，以解决现有技术中的问题。为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种通过金磁纳米免疫层析试纸条对肉制品中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的快速检测的快速检测方法，包括以下步骤：（1）按照纳米金磁免疫层析法分别测定不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液和莱克多巴胺标准溶液，获取磁性信号，分别绘制盐酸克伦特罗标准曲线和莱克多巴胺标准曲线，以及确定纳米金磁免疫层析法中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的检测灵敏度；（2）对实际猪肉样品按照纳米金磁免疫层析法进行检测，通过盐酸克伦特罗标准曲线和莱克多巴胺标准曲线确定样品盐酸克伦特罗和莱克多巴胺含量。进一步的技术方案是，所述方法中，所述纳米金磁免疫层析法采用金磁侧向流层析试纸条，所述金磁侧向流层析试纸条包括：(1)叠置在固相支持垫上的多孔滤膜，其中所述多孔滤膜设置有沿液体流动方向而被物理性分离的检测区域和质控区域；所述检测区域分别固定有盐酸克伦特罗-BSA偶联抗原和莱克多巴胺-BSA偶联抗原；所述质控区域固定有质控试剂；(2)结合物释放垫，与所述多孔滤膜流体连通，且沉积有与液体样品接触后可释放的结合物探针，其中所述结合物探针为金磁纳米颗粒标记的盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的单克隆抗体；(3)吸收垫，用于收集流经所述检测和质控区域的所述液体。进一步的技术方案是，所述方法中，所述纳米金磁免疫层析法包括按照免疫层析法的步骤将金磁侧向流层析试纸条的样品端浸入样品液体中，层析过程中待测物与层析材料上针对待测物的受体发生免疫反应，免疫反应的复合物被富集或截留在检测区域，然后通过磁性检测仪器获取磁性信号的步骤。进一步的技术方案是，所述方法中，所述的磁性检测仪器为磁性阅读仪。进一步的技术方案是，所述方法中，所述检测区域设置两个检测线，其中T1线固定有盐酸克伦特罗BSA偶联抗原，用于检测盐酸克伦特罗；T2线固定有莱克多巴胺BSA偶联抗原，用于检测莱克多巴胺。进一步的技术方案是，所述方法中，金磁纳米颗粒标记的盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的单克隆抗体按照如下步骤进行制备：1）γ-Fe2O3纳米颗粒制备：以FeCl3、FeCl2为原料通过化学共沉淀法获取Fe3O4纳米颗粒；清洗后将获得Fe3O4纳米颗粒分散在HNO3溶液加热至90℃反应1小时，反应完全后得到γ-Fe2O3纳米颗粒；2）核壳结构的金磁纳米颗粒制备：将制得的γ-Fe2O3纳米颗粒分散在纯水中稀释至1.1mol/L；在柠檬酸钠作为表面活性剂的条件下依次加入NH2OH·HCl、氯金酸进行反应；重复依次加入NH2OH·HCl、氯金酸进行反应获得金磁纳米颗粒即Au/Fe2O3胶体颗粒；3）金磁纳米颗粒标记的盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的单克隆抗体制备：将制备的金磁纳米颗粒，用pH=7.4的PBS缓冲溶液润洗后，纯化分离出金磁纳米颗粒，然后在pH=7.4的PBS缓冲溶液中分散，缓慢加入等摩尔比的盐酸克伦特罗抗体和莱克多巴胺抗体，并震荡摇匀，缓慢加入PEG20000，继续震荡20min，加入10%的牛血清蛋白溶液至终浓度为1%，磁性分离，弃上清，沉淀用pH=7.4的PBS缓冲溶液清洗，纯化分离，制得的金磁-盐酸克伦特罗抗体和金磁-莱克多巴胺抗体分散于pH=7.4的PBS缓冲溶液中，4℃保存。进一步的技术方案是，所述方法中，金磁纳米颗粒是内层为γ-Fe2O3，外层为Au包覆的核壳纳米复合材料；所述金磁纳米颗粒的粒径在20~80nm范围内；优选的，金磁纳米颗粒的粒径为50nm。进一步的技术方案是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用纳米金磁免疫层析法测定猪肉中瘦肉精含量的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（1）按照纳米金磁免疫层析法分别测定不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液和莱克多巴胺标准溶液，获取磁性信号，分别绘制盐酸克伦特罗标准曲线和莱克多巴胺标准曲线，以及确定纳米金磁免疫层析法中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的检测灵敏度；（2）对实际猪肉样品按照纳米金磁免疫层析法进行检测，通过盐酸克伦特罗标准曲线和莱克多巴胺标准曲线确定样品盐酸克伦特罗和莱克多巴胺含量。

【技术特征摘要】
1.一种利用纳米金磁免疫层析法测定猪肉中瘦肉精含量的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（1）按照纳米金磁免疫层析法分别测定不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液和莱克多巴胺标准溶液，获取磁性信号，分别绘制盐酸克伦特罗标准曲线和莱克多巴胺标准曲线，以及确定纳米金磁免疫层析法中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的检测灵敏度；（2）对实际猪肉样品按照纳米金磁免疫层析法进行检测，通过盐酸克伦特罗标准曲线和莱克多巴胺标准曲线确定样品盐酸克伦特罗和莱克多巴胺含量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述方法中，所述纳米金磁免疫层析法采用金磁侧向流层析试纸条，所述金磁侧向流层析试纸条包括：(1)叠置在固相支持垫上的多孔滤膜，其中所述多孔滤膜设置有沿液体流动方向而被物理性分离的检测区域和质控区域；所述检测区域分别固定有盐酸克伦特罗-BSA偶联抗原和莱克多巴胺-BSA偶联抗原；所述质控区域固定有质控试剂；(2)结合物释放垫，与所述多孔滤膜流体连通，且沉积有与液体样品接触后可释放的结合物探针，其中所述结合物探针为金磁纳米颗粒标记的盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的单克隆抗体；(3)吸收垫，用于收集流经所述检测和质控区域的所述液体。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述方法中，所述纳米金磁免疫层析法包括按照免疫层析法的步骤将金磁侧向流层析试纸条的样品端浸入样品液体中，层析过程中待测物与层析材料上针对待测物的受体发生免疫反应，免疫反应的复合物被富集或截留在检测区域，然后通过磁性检测仪器获取磁性信号的步骤。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述方法中，所述的磁性检测仪器为磁性阅读仪。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述方法中，所述检测区域设置两个检测线，其中T1线固定有盐酸克伦特罗BSA偶联抗原，用于检测盐酸克伦特罗；T2线固定有莱克多巴胺BSA偶联抗原，用于检测莱克多巴胺。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，金磁纳米颗粒标记的盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的单克隆抗体按照如下步骤进行制备：1）γ-Fe2O3纳米颗粒制备：以FeCl3、FeCl2为原料通过化学共沉淀法获取Fe3O4纳米颗粒；清洗后将获得Fe3O4纳米颗粒分散在HN...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈军，那晶晶，
申请(专利权)人：陈军，那晶晶，
类型：发明
国别省市：江苏;32