一种联合检测评估肝癌肝移植术后转移复发风险的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及医学生物检测领域，具体是一种将AFP和iFISH‑CTC检测联合使用，用于评估肝癌肝移植术后转移复发风险的检测试剂或试剂盒及其检测方法。本发明专利技术通过检测AFP含量和CTC数目，评估肝癌肝移植术后转移复发的风险，为肝癌肝移植术后转移复发检测提供了新的手段，以便尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学生物检测
，具体地说，是一种将AFP和iFISH-CTC检测联合使用，用于评估肝癌肝移植术后转移复发风险的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球最常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在所有肿瘤疾病中分列第五位和第三位(ZhangY,LiJ,CaoL,etal.Circulatingtumorcellsinhepatocellularcarcinoma:detectiontechniques,clinicalimplications,andfutureperspectives[J].SeminOncol,2012,39(4):449-460.)。我国是肝病大国，每年约有11万人死于HCC，占全球肝癌死亡人数的45％。肝移植是治疗肝癌的重要手段之一，肝癌患者约占我国每年肝移植受体总数的40-50％，即使经过多种治疗手段(手术切除、放疗，化疗及联合治疗方法)，HCC患者预后仍然不佳，肝癌切除术后1年复发率高达40％，而肝移植术后1年复发率也超过10％(MazzaferroV,LlovetJM,MiceliR,etal.PredictingsurvivalafterlivertransplantationinpatientswithhepatocellularcarcinomabeyondtheMilancriteria:aretrospective,exploratoryanalysis[J].LancetOncol,2009,10(1):35-43.)。秉承早发现早治疗的原则，及早发现肝癌的发生和转移，对于改善患者预后，提高临床治疗效果至关重要。甲胎蛋白(Alphafetoprotein，AFP)是一种糖蛋白，主要是胚胎内胚层相关组织细胞的同源蛋白产物。肝癌是造成血清中AFP含量升高的原因之一，但临床上存在三分之一肝癌患者的AFP水平未明显升高，而且在慢性活动性肝炎(CAH)患者也有20％-40％的人的AFP升高。因此2010版美国肝病研究协会(AASLD)建议在常规监测HCC时以B超为主，不再将AFP作为常规筛查指标。但是在肝癌肝移植术后转移复发风险评估过程中，同一患者AFP水平高低具有参考价值，可作为治疗成功与否，是否复发的重要指标。循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,CTC)是自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。肝癌细胞极易通过血液播散，部分肝癌患者在肝癌切除或肝移植前，已有肿瘤细胞脱落进入血液循环系统中(Paterlini-BrechotP,BenaliNL.Circulatingtumorcells(CTC)detection:clinicalimpactandfuturedirections[J].CancerLett,2007,253(2):180-204.)，手术中对肿瘤的挤压操作又可能导致肿瘤细胞通过血液播散。并且肝移植术后的免疫抑制状态使得CTC产生并存活的概率大大增加，入血的CTC是导致肝癌术后复发和转移的首要条件。临床研究显示HCC肝移植术后移植肝是肝癌早期复发的最常见部位，这一过程被称为肿瘤细胞自我种植(KimMY,OskarssonT,AcharyyaS,etal.Tumorself-seedingbycirculatingcancercells[J].Cell,2009,139(7):1315-1326.)。自我种植的肿瘤细胞不仅能够通过原位继续生长，还能促进新生血管和基质形成，提示HCC-CTC在肝移植术后肝癌复发和转移中发挥关键作用。而临床缺乏有效手段检测HCC-CTC，难以对可能出现复发转移的高危患者进行筛查和针对性的预防治疗，一旦通过影像学手段发现HCC复发转移，往往意味着患者最终难逃死亡的厄运。因此，将甲胎蛋白检测与iFISH-CTC检测结合为HCC的术后评估和治疗反应提供了一种强大的非侵入性方法。目前对于肝癌的诊断主要依靠影像学检查，甲胎蛋白检测结合iFISH-CTC联合检测来评估肝癌肝移植术后转移复发风险的检测指标还未有相关文献报道和临床应用。中国专利文献CN103866016A公开了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用，可用于肿瘤病人微创液体活检，实现肿瘤转移复发的早期诊断和预警，监控抗肿瘤治疗疗效及肿瘤进展情况。但其检测主要依赖于肿瘤细胞对EpCAM的表达。有报道显示，HCC的EpCAM的表达率仅为14.3-39％。同时，在肿瘤的进展过程中，CTC会发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)从而丢失包括EpCAM在内的部分上皮表型。因此，EpCAM含量并不能完全代表体内循环肿瘤细胞的水平，而本专利技术中采用的iFISH-CTC检测能够准确定义样本中CTC的数目，单独使用iFISH的检测的特异度达到76.2％，结合血清中AFP含量分析后，在保持高特异度(71.4％)的基础上显著提升了敏感度(88.9％)，本专利技术在评估肝癌肝移植术后转移复发的风险方面具有优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于有效评估肝癌肝移植术后转移复发的风险，提供一种特异性和敏感性都极好的检测肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒及其检测方法。为了实现上述目的，本专利技术的主要技术方案为：本专利技术的第一方面，提供甲胎蛋白(AFP)和循环肿瘤细胞(CTC)在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用。所述的检测试剂或试剂盒通过检测肝癌患者肝移植后血清中AFP含量和血液中CTC数目，评估肝癌肝移植术后转移复发的风险，预测肝移植后是否发生转移，为后续治疗提供指导意见。本专利技术的检测试剂或试剂盒是一种血清学检测试剂或试剂盒。本专利技术的检测试剂，是检测AFP含量的试剂和检测CTC数量的试剂的组合。本专利技术的试剂盒，包含检测AFP含量的试剂和检测CTC数量的试剂。优选的，所述的血液中CTC数目采用iFISH检测。优选的，所述的检测试剂为检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂的组合。优选的，所述的试剂盒包含检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂。本专利技术在肝癌患者进行肝移植后定期随访，并采集外周血。利用UniCelDxI800自动微粒子发光免疫分析仪对分离得到的血清进行AFP检测。运用梯度离心和免疫吸附方法进行对阴性富集，对已富集人外周血循环肿瘤细胞的载玻片进行免疫荧光染色，使用荧光显微镜进行结果判读。监测肝癌患者进行肝移植手术后体内AFP含量和CTC数目的动态变化。本专利技术通过监测30例肝癌肝移植患者术前术后血清中AFP含量和CTC数目，通过ROC分析及秩和检验发现，AFP和iFISH联合诊断复发前3个月效果显著AUC联合复发前＝0.831，P＜0.01。预测效果好于AFP和iFISH单独诊断，AUCAFP＝0.643，P>0.05；AUCiFISH＝0.643，P>0.05。虽然AFP单纯检测特异度达到95.2％，但是其敏感度只有33.3％。iFISH单纯检测敏感度和特异度分别为66.7％和76.2％。AFP+iFISH联合检测则能够将敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒通过检测肝癌患者肝移植后血清中AFP含量和血液中CTC的数目，评估肝癌肝移植术后转移复发的风险。3.根据权利要求2所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的血液中CTC的数目采用iFISH检测。4.根据权利要求1-3任一所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂为检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂的组合。5.根据权利要求1-3任一所述的AFP和CTC在制备评估肝癌肝移植术后转移复发的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包含检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂。6.一种评估肝癌肝移植术后转移复发的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测血清中AFP含量的试剂，和采用iFISH检测血液中CTC数目的试剂。7.根据权利要求6所述的评估肝癌肝移植术后转移复发的试剂盒，其特征在于，所述的检测血清中AFP含量的试剂为采用UniCelDxI800自动微粒子发光免疫分析仪检测血清中AFP含量的试剂。8.根据权利要求7所述的评估肝癌肝移植术后转移复发的试剂盒，其特征在于，所述的检测血清中AFP含量的试剂包括：A)R1：AccessAFP试剂盒：6盒装，50个测试/盒；B)R1a：包被有大鼠抗AFP单抗的磁性颗粒悬浮于...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛峰，夏强，顾健人，张桢珍，施少军，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31