可在体外制备肝芽的细胞共培养方法和肝芽技术

本发明专利技术涉及一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，包括以下步骤：(1)将肝样细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞分别消化、重悬于培养基中，按肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.5～1.5：0.3～1混合，得混合细胞悬液；所述肝样细胞为采用诱导性多能干细胞定向诱导分化而成；(2)将所述混合细胞悬液均匀种植在培养皿进行培养3～7天至肝芽形成。本发明专利技术尽可能模拟了细胞在体内的生存环境，并优化了培养体系，突破了常规细胞培养的缺陷与不足，最终由细胞产生了微小的三维结构，为组织工程领域开拓了新的研究领域，也为再生医学研究提供了新的思路和方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞工程和组织工程领域，尤其是涉及一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法和肝芽。
技术介绍
肝脏是机体最重要的器官之一，它在机体的代谢、胆汁生成、解毒、凝血、免疫、热量产生及水与电解质的调节中均起着非常重要的作用。终末期肝病是指各种原因导致的进行性不可逆的肝脏损害，经常规的内外科治疗无法治愈，症候险恶，预计在短期内(6-12个月)无法避免死亡，在各种炎症因子的作用下，肝脏大多数功能极度衰竭，并往往伴有多种高危并发症。据统计，全球有大约6亿人面临终末期肝病的威胁，其死亡率高达50％–80％。原位肝移植被认为是目前治疗终末期肝病最有效的手段，但是因为肝源稀缺，目前全球需要的病人中仅有25％能够获得所需要的肝源。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，因其具有多向分化潜能和无限增殖能力，为终末期肝病的治疗提供了充足的细胞来源。研究发现，胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESCs)或者诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)等可在特定的条件下诱导分化为具有一定功能的肝脏前体细胞，具有成熟肝细胞功能，如合成尿素、储存糖原、分泌白蛋白等。因此，干细胞治疗有望代替原位肝移植成为治疗终末期肝病的新途径。但是细胞在常规培养的过程中，虽然处于模拟的体内环境，可该环境与真正的体内环境之间仍然存在很大差异，细胞在生长过程中可能会产生一些微观变化，并不能代表体内细胞的真实状态。而细胞共培养技术将不同种类、不同来源的细胞在同一个体系中进行培养、增殖，尽可能模拟自然条件下的细胞内环境，能使细胞间相互沟通信息并支持生长增殖。Lawrence于1978年首次通过大鼠卵巢颗粒细胞和小鼠心肌细胞的共培养实验，研究异种细胞之间的间隙连接通信。Feng，Wang等人应用自体骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养，研究软骨细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用，以及这两种细胞在修复关节软骨损伤中的作用。Wang等人通过共培养实验研究骨髓间充质干细胞对造血干细胞扩增的促进作用。Zhang等通过将人肝细胞系L02和骨髓间充质干细胞在体外共培养，将间充质干细胞诱导分化为肝细胞。目前，细胞共培养在其培养的细胞种类、条件和方法等方面均取得了很大的进展，并且一种由细胞共培养产生的芽器官引起了广泛的关注。2013年，Takebe等人利用人诱导性多功能干细胞来源的肝脏内胚层细胞与人脐静脉内皮细胞以及间充质干细胞在体外共培养产生了简单的人类肝脏(后称之为“肝芽”)，将其移植到小鼠体内后，这些肝脏成功血管化并正常行使功能。此后进一步证明细胞共培养同样可以适用于肠、肺、心、肾、脑等微器官的产生，为终末期肝病的治疗提供了新的思路。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法和肝芽。利用iPSCs来源的肝样细胞(hepatocyte-likecells，HPLCs)与内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)以及间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)在体外按比例共培养制备肝芽。具体技术方案如下：一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，包括以下步骤：(1)将肝样细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞分别消化、重悬于培养基中，按肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.5～1.5：0.3～1混合，得混合细胞悬液；所述肝样细胞为采用诱导性多能干细胞定向诱导分化而成；(2)将所述混合细胞悬液均匀种植在培养皿进行培养3～7天至肝芽形成。上述步骤(2)中的培养时间优选为3～5天。在其中一些实施例中，所述混合细胞悬液中的混合细胞总数为5×105～1×106个/cm2。在其中一些实施例中，在所述步骤(1)中，所述肝样细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为4.3×105～1.7×106个；所述内皮祖细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为3×105～1.6×106个；所述间充质干细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为1.6×105～1.2×106个。在其中一些实施例中，所述步骤(1)中的肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.8～1：0.4～0.6。在其中一些实施例中，在所述步骤(1)中，所述肝样细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为5.8×105～1.4×106个；所述内皮祖细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为5×105～1.3×106个；所述间充质干细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为2.5×105～7.5×105个。在其中一些实施例中，所述步骤(1)中的培养基为添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基。在其中一些实施例中，所述步骤(1)中的添加有胎牛血清、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中胎牛血清的体积浓度为10％，地塞米松的浓度为0.05-1.2μM，L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。在其中一些实施例中，在所述步骤(1)中，还包括使用Cellstain-CFSE(CFSE)对重悬后的所述肝样细胞进行染色，以及使用RhodaminelabeledUlexEuropaeusAgglutininI(UEAI)对重悬后的内皮祖细胞进行染色，均在避光条件下进行。上述步骤为对体外制备的肝芽进行鉴定及其组成的细胞进行动态观测。上述培养皿是指底面积为2.89cm2的中央孔器官培养皿；培养条件是于37℃，5％CO2的条件下。在其中一些实施例中，在所述步骤(1)中的所述肝样细胞由诱导性多能干细胞定向诱导分化而成的具体步骤如下：步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；步骤S2，将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；步骤S3，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；步骤S4，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。在上述步骤S1中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化为诱导性多能干细胞；所述诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。在上述步骤S2中，使用所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基培养22～50小时后，更换使用所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基培养46～98小时，并且在后续培养过程中每22～26小时更换一次培养基。所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPMI-1640培养基中所述人活化素A的浓度为5-300ng/ml，所述Wnt3a的浓度为20-100ng/ml；所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPMI-1640培养基中所述人活化素A的浓度为10-200ng/ml，所述胎牛血本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将肝样细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞分别消化、重悬于培养基中，按肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.5～1.5：0.3～1混合，得混合细胞悬液；所述肝样细胞为采用诱导性多能干细胞定向诱导分化而成；(2)将所述混合细胞悬液均匀种植在培养皿进行培养3～7天至肝芽形成。

【技术特征摘要】
1.一种可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将肝样细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞分别消化、重悬于培养基中，按肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.5～1.5：0.3～1混合，得混合细胞悬液；所述肝样细胞为采用诱导性多能干细胞定向诱导分化而成；(2)将所述混合细胞悬液均匀种植在培养皿进行培养3～7天至肝芽形成。2.根据权利要求1所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，所述混合细胞悬液中的混合细胞总数为5×105～1×106个/cm2。3.根据权利要求2所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述肝样细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为4.3×105～1.7×106个；所述内皮祖细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为3×105～1.6×106个；所述间充质干细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为1.6×105～1.2×106个。4.根据权利要求3所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的肝样细胞的数量：内皮祖细胞的数量：间充质干细胞的数量为1：0.8～1：0.4～0.6。5.根据权利要求4所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述肝样细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为5.8×105～1.4×106个；所述内皮祖细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为5×105～1.3×106个；所述间充质干细胞在每1ml所述混合细胞悬液中的数量为2.5×105～7.5×105个。6.根据权利要求1～4任一项所述的可在体外制备肝芽的细胞共培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养基为添加有胎牛血清...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙懿，林戈，卢光琇，
申请(专利权)人：湖南光琇高新生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43