本发明专利技术公开了一种如式I所示的β‑1,2‑D‑寡聚甘露糖肽‑蛋白缀合物及其制备方法和应用，式中n为0、1或2，R为载体蛋白KLH或HSA。本发明专利技术以α‑D‑葡萄糖及丙氨酸树脂为原料，合成了β‑1,2‑D‑寡聚甘露糖肽，并将其与载体蛋白偶联得到相应的β‑1,2‑D‑寡聚甘露糖肽‑蛋白缀合物。将制备的化合物作为抗白念珠菌疫苗免疫小鼠，结果表明本发明专利技术的化合物能诱导机体产生较强的免疫应答，其中β‑1,2‑D‑甘露三糖肽‑蛋白缀合物的免疫原性最强且产生的免疫血清能够与白念珠菌细胞表面抗原相结合，从而可以达到抗白念珠菌感染的作用，本发明专利技术的β‑1,2‑D‑寡聚甘露糖肽‑蛋白缀合物具有较强的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗真菌糖肽疫苗领域
，具体地说，是一种β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物及其制备方法，该类糖肽-蛋白缀合物作为疫苗在白念珠菌感染的预防和治疗中的应用。
技术介绍
现阶段，临床上由白念珠菌引起的真菌感染呈不断上升趋势，且病菌针对抗菌药物已产生严重的耐药性，研究新型抗白念珠菌真菌疫苗无疑提供了很好的治疗手段和策略。目前，此类疫苗的研究靶标主要集中在白念珠菌细胞表面的功能蛋白及多糖等方面。研究发现，白念珠菌的细胞壁中含有的多种不同类型的蛋白与真菌的侵入、粘附、吞噬等功能密切相关，而且这些蛋白具有一定的免疫原性，作为抗原被用于真菌疫苗的设计。磷酸化的β-1,2-甘露聚糖是存在白念珠菌细胞表面的T-细胞依赖型多糖抗原，通常将它们与载体蛋白(BSA/TT)偶联形成糖蛋白疫苗。但通过研究我们发现上述疫苗的设计都存在一定的不足：仅以细胞表面蛋白或将β-1,2-寡聚甘露糖与载体蛋白结合形成的糖蛋白复合物作为疫苗免疫小鼠，引起的免疫应答有限。本研究我们拟将合成的磷酸化的β-1,2-寡聚甘露糖与选自白念珠菌细胞表面蛋白Als1的N-端氨基酸序列的多肽连接形成糖肽，并将它们与载体蛋白钥孔虫戚雪蓝蛋白(KLH)偶联形成糖肽-蛋白缀合物，以期得到高免疫原性的糖肽-蛋白疫苗。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物。本专利技术的第二个目的是，提供如上所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物的制备方法。本专利技术的第三个目的是，提供如上所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物的用途。本专利技术的第四个目的是，提供提供一种抗白念珠菌真菌疫苗。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物，所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物结构通式为：其中，n为0、1或2，R为载体蛋白KLH或HSA。进一步，所述组成寡糖的单糖单元为β-1,2-D-甘露糖。进一步，所述多肽序列选自于白念珠菌细胞表面蛋白Als1的N-端氨基酸序列。进一步，以磷酸乙醇胺基作为β-1,2-D-寡聚甘露糖和多肽的连接基团。进一步，所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物由磷酸化的β-1,2-D-寡聚甘露糖肽与载体蛋白偶联制得。进一步，以戊二酰基作为β-1,2-D-寡聚甘露糖肽和载体蛋白的连接基团。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上任一所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物的制备方法，包括如下步骤：第一步，合成β-1,2-D-甘露二糖(受体7)、β-1,2-D-甘露三糖受体(受体10)：第二步，合成磷酸化β-1,2-D-寡聚甘露糖19a-c：第三步，合成多肽21：第四步，合成β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物：进一步，所述磷酸化β-1,2-D-寡聚甘露糖制备方法方法如下：(1)以α-D-葡萄糖为原料，在反应助剂的作用下制备β-1,2-D-甘露单糖受体和3,4,6-三苄基-2-乙酰氧基葡萄糖三氯乙酰亚胺酯供体；(2)上述制备的单糖供体和单糖受体在催化剂(TMSOTf)作用下发生糖基化反应制备二糖，在二糖的2’-位上通过构型翻转制备β-1,2-D-甘露二糖受体；β-1,2-D-甘露二糖受体和单糖供体通过前述方法制备β-1,2-D-甘露三糖受体；(3)β-1,2-D-甘露糖受体分别和6-叔丁基二苯基硅基-3,4-二苄基-2-乙酰氧基葡萄糖三氯乙酰亚胺酯供体经糖基化作用制备相应β-1,2-D-寡聚甘露糖；寡聚甘露糖非还原端6-位脱掉TBDPS保护后和磷酸化试剂反应制得磷酸化β-1,2-D-寡聚甘露糖。进一步，所述多肽21的制备方法为：以Fmoc-L-丙氨酸树脂为原料，采用固相合成方法合成多肽21。进一步，所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物制备方法包括如下步骤：(1)将磷酸化β-1,2-D-寡聚甘露糖与多肽21经缩合反应制得β-1,2-D-寡聚甘露糖肽；(2)将步骤1制备的β-1,2-D-寡聚甘露糖肽与羟琥珀酰亚胺戊二酸酯反应制得β-1,2-D-寡聚甘露糖肽活化酯；(3)将步骤2制备的活化酯在弱碱性条件下与载体蛋白偶联，得β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上任一所述的β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物在制备预防和/或治疗真菌感染的药物中的应用；所述真菌为白念珠菌。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种抗白念珠菌真菌疫苗，包括如上所述治疗有效量的β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物和药学上可接受的辅料或佐剂。本专利技术优点在于：本专利技术制备的KLH-糖肽-蛋白缀合物作为抗真菌疫苗皮下免疫小鼠，能诱导机体产生较强的免疫应答，其中β-1,2-D-甘露三糖肽-蛋白缀合物的免疫原性最强且产生的免疫血清能够与白念珠菌细胞表面抗原相结合，从而可以达到抗白念珠菌感染的作用，本专利技术的β-1,2-D-甘露三糖肽-蛋白缀合物具有较强的应用价值。附图说明附图1是β-1,2-D-寡聚甘露糖蛋白结合物通式。附图2是β-1,2-D-甘露二糖、β-1,2-D-甘露三糖受体合成路线。反应条件：a)TMSOTf，CH2Cl2，分子筛，-40℃，92.4％；b)CH3ONa，CH3OH，94.2％；c)i)DMSO，Ac2O；ii)L-selectride，THF，-78℃，79.5％(两步总收率)；d)TMSOTf，CH2Cl2，分子筛，-40℃，90.3％；e)CH3ONa，CH3OH，92.7％；f)i)DMSO，Ac2O；ii)L-selectride，THF，-78℃，77.6％(两步总收率)。附图3是磷酸化β-1,2-D-寡聚甘露糖二糖、三糖合成路线。反应条件：a)TMSOTf，CH2Cl2，分子筛，-40℃，(12a，84.3％；12b，89.5％；12c，81.5％)；b)CH3ONa，CH3OH，91.3-95.5％；c)i)DMSO，Ac2O；ii)L-selectride，THF，-78℃，79.6-84.5％(两步总收率)；d)BnBr，NaH，TBAI，0℃，83.7-89.4％；e)TBAF，THF，83.4-88.2％；f)i)Tetrazole,CH2Cl2/CH3CN；ii)tert-BuOOH，79.3-87.5％(两步总收率)；g)DBU，CH2Cl2，86.3-93.2％。附图4是多肽21的固相合成方法。反应条件:a)HBTU,HOBt,DIPEA,DMF；b)Piperidine/DMF＝(1:4，体积比)；c)AcOH/TFE/DCM(2:1:16，体积比)。附图5是糖肽疫苗目标化合物的合成路线。反应条件：a)EDC，HOBt，CH2Cl2/NMP(2:1，体积比)，0℃，78.9-83.2％；b)i)H2，Pd(OH)2/C，CH2Cl2/MeOH(1:2，体积比)，24小时；ii)TFA/TES/DCM(3:1:6，体积比)，2小时，78.4-82.7％(两步总收率)；c)DMF/PBS缓冲液(4:1，体积比)，4小时；d)PBS缓冲液，2.5天。附图6是化合物1a-c免疫小鼠后检测血清中总抗体滴本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β‑1,2‑D‑寡聚甘露糖肽‑蛋白缀合物，其特征在于，所述β‑1,2‑D‑寡聚甘露糖肽‑蛋白缀合物结构通式为：其中，n为0、1或2，R为载体蛋白KLH或HSA。
【技术特征摘要】
1.一种β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物，其特征在于，所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物结构通式为：其中，n为0、1或2，R为载体蛋白KLH或HSA。2.根据权利要求1所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物，其特征在于，组成寡糖的单糖单元为β-1,2-D-甘露糖；所述多肽序列选自白念珠菌细胞表面蛋白Als1的N-端氨基酸序列。3.根据权利要求1所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物，其特征在于，以磷酸乙醇胺基作为β-1,2-D-寡聚甘露糖和多肽的连接基团；以戊二酰基作为β-1,2-D-寡聚甘露糖肽和载体蛋白的连接基团。4.根据权利要求1所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物，其特征在于，所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物由磷酸化的β-1,2-D-寡聚甘露糖肽与载体蛋白偶联制得。5.权利要求1所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，合成β-1,2-D-甘露二糖(受体7)、β-1,2-D-甘露三糖受体(受体10)：第二步，合成磷酸化β-1,2-D-寡聚甘露糖19a-c：第三步，合成多肽21：第四步，合成β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物：6.根据权利要求5所述β-1,2-D-寡聚甘露糖肽-蛋白缀合物的制备方法，其特征在于，所述磷酸化β-1,2-D-寡聚甘露糖制备方法方法如下：(1)以α-D-葡萄糖为原料，在反应助剂的作用下制备β-1,2-D-甘露单糖受体和3,4,6-三苄基-2-乙酰氧基葡萄糖三氯乙酰亚胺酯供体；(2)上述...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘炜华，潘搏，廖俊，廖万清，桑军军，李颖芳，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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