鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用制造技术

本发明专利技术属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株及其制备与应用。所述减毒株为spiC基因和rfc基因都不表达的鸡白痢沙门菌。本发明专利技术通过动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短。采用所述减毒株制备鸡白痢沙门菌活疫苗，鸡只接种所述疫苗后，无不良反应，可有效清除强毒力菌株感染。宿主不产生针对O-抗原的抗体，通过鸡白痢鸡伤寒多价检测抗原，可有效地应用玻板凝集试验对免疫接种鸡和自然感染鸡予以区分，具有DIVA疫苗的特征。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用。
技术介绍
鸡白痢是由鸡白痢沙门菌(SalmonellaPullorum)引起的一种多发性传染病，对我国的养鸡业危害极大。该病原菌除了能够水平传播，还可经蛋垂直传播而导致孵化率和出雏率的降低，多侵害20日龄以内雏鸡，以白色下痢为特征，表现急性败血症经过，发病率和病死率相当高；成年鸡多为慢性或隐性感染，一般无明显临诊症状。防治此病的传统方法是使用抗生素类药物，长期使用易引起药物残留和细菌耐药性增强等诸多影响，因此，以疫苗预防鸡白痢的研究颇受重视。根据长期以来对鸡白痢沙门菌防控措施的探索和实践，鸡白痢沙门菌的控制依赖一个地区的感染程度。感染水平低或可实施检疫淘汰制度的地区可采取血清学检测和扑杀的办法控制鸡白痢，感染水平高或者无法进行淘汰扑杀的地区考虑使用疫苗。因此，理想的鸡白痢沙门菌减毒活疫苗除了应具备安全性和有效性外，最好还应具备DIVA(DifferentiationofInfectedandVaccinatedAnimals,DIVA)的特点，即通过简单有效的血清学检测方法，就能区分疫苗免疫动物和自然感染动物，以指导生产现场的疫苗使用。O-抗原是革兰阴性菌细胞最外层结构脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的主要组成部分，不仅是病原菌的致病因子，其特异多糖重复单元的数目差异也是O-血清分型的依据。基于LPS特异性的玻板凝集试验以其简单易行的操作特点，目前在国内外被广泛用于鸡白痢的检疫诊断。综上所述，O-抗原可作为新型鸡白痢沙门菌减毒活疫苗的操作靶点和选择标志，用以构建DIVA疫苗。DIVA活疫苗已在畜禽中成功应用于防止病毒感染。重组自杀质粒技术和Red同源重组技术作为基因突变方法已经被广泛应用于细菌的基因敲除与基因替换。沙门菌spiC与致病性密切相关，rfc参与细菌LPS的生物合成。双基因敲除极大地降低了减毒活疫苗在实际应用过程中发生回复突变的可能性，在不影响免疫原性的前提下，最大程度的规避毒力返祖的风险，保证了疫苗的安全性。
技术实现思路
鉴于以上现有技术的情况，本专利技术的目的在于提供一种鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株及其制备与应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfc基因都不表达的鸡白痢沙门菌。优选的，所述鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfc基因都被敲除的鸡白痢沙门菌。鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：Accession:NC_021984.1；GI:529218781。spiC基因为现有技术，具体信息为：Accession:JN673268.1；GI:374304599。rfc基因为现有技术，具体信息为：ACCESSION:CP006575；REGION:1181776..1182999。只要将鸡白痢沙门菌中的spiC基因和rfc基因都进行敲除，使得spiC基因和rfc基因都不表达，即可获得鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株。优选地，本专利技术一实施例中，被敲除的spiC基因的序列如SEQIDNO.1所示，具体为：TCTGAGGAGGGATTCATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATTCCATTAATTCAGGATATCAAGGCCGAAGGTAATAGCCGATCCTGGATAATGACTATTGATGGGCATCCTGCCAGAGGAGAAATTTTCTCAGAAGCATTTTCTATTTCTTTGTTCTTAAATGACCTGGAAAGCTTACCTAAGCCTTGTCTTGCCTATGTGACACTACTGCTTGCAGCACACCCGGACGTACATGATTATGCTATACAGCTCACAGCGGATGGGGGATGGTTAAACGGTTATTATACCACAAGTAGTAGCTCTGAGCTTATTGCTATTGAGATAGAAAAACACCTGGCTTTAACTTGCATTTTAAAAAATGTAATACGCAATCACCATAAACTTTATTCGGGTGGGGTATAA。优选地，本专利技术一实施例中，被敲除的rfc基因的序列如SEQIDNO.2所示，具体为：ATGCTTATAATTTCATACATTGTATTATGCTTATTATTTATAGTTTATCTCTATACTCTTTCCGTAAGAATTGAGGGAAAAATAATAAATGTAATGGTCCCATACCTGATAATAACAGTGCCTACACTGTACGTGTTTGAAGGTATATTTGTATACCTCTCAGAGGTGCGGAAGTATACAGTGGAATATTTGTTTTTCTATACTTGCTATATAACATACATAGCATCATTTGTTATTTCTTATCTTTACACACAAAGAAAACCCATATACAACAAATCAAACACAAAAAATAAACCAAGGTATGTGTTTACTTCATTGTTATTCACCTTCCTTGCTTTTATCATTTACCTTCCAGTGTTGATGGAGTTCAGAGAGTACATACTTAGCCCAAGAAGAATATACGAATTAACCAGAACAGGGTATGGTATATACTTCTATCCTTCATTAATGTTTTCTCTTGTCGCTTCTATTTGCGCGTTCTTTACATACAAAAAATCAAAGTTATTTTGTATTTCCATAGTTTTATTTAACTGTATACTTATTTTCTTGCATGGTAACAAAGGACCAATATTTAGTATATTTATAGCATTCATCCTTTATCTTTCATATATTGAAAATAAAAAAATTAAATTTATGTTCCTGGTGAAATCGTTTGCTGTTATAGCAGTCATTGTAACGGCATTCTTTGCATATACGTTTACTGATGGGAATCCGATAGAAAATATGGCGAATTACTCGGATTATACCCGTAATGCTGTTCTTGTTGCCTCCTCAAACTTTGACTTTATGTACGGAAAATTACTAATGGAGAGCGAGGTTTACTCGAGAATTCCGAGGGCTATTTGGCCTGATAAGCCTGAAGATTTTGGCGCATTGTATCTGGCAAAAGTATTTTTCCCTGATGCATTCTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡白痢沙门菌spiC‑rfc双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfc基因都不表达的鸡白痢沙门菌。

【技术特征摘要】
1.一种鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfc基因都不表达的鸡
白痢沙门菌。
2.根据权利要求1所述的鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfc
基因都被敲除的鸡白痢沙门菌。
3.根据权利要求2所述的鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株，其特征在于，被敲除
的spiC基因的序列如SEQIDNO.1所示。
4.根据权利要求2所述的鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲除减毒株，其特征在于，被敲除
的rfc基因的序列如SEQIDNO.2所示。
5.如权利要求1～4任一权利要求所述鸡白痢沙门菌spiC-rfc双基因敲...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，郭荣显，耿士忠，焦扬，朱姗姗，潘志明，孙林，陈祥，李求春，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32