一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。本发明专利技术涉及CPV治疗性单克隆抗体制备而成的试纸条，定量检测时将犬血清从1:10开始倍比稀释，与16个抗原单位的CPV标准抗原中和后，再滴入本试纸条中，试纸条检测线(T线)消失时的血清最高稀释倍数为试纸条检测效价(CGIA效价)，CGIA效价乘以4即为犬血清中抗体HI效价；使用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以8即为HI效价；使用8抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以2即为HI效价；使用4抗原单位的标准抗原时，CGIA效价等于HI效价。本方法与血凝血抑检测方法结果的符合率达90.7％，抗体定性检测结果的符合率达98.8％，可用于CPV疫苗免疫效果评价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽医生物
，涉及一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。
技术介绍
犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属，是自主复制型单链DNA病毒，直径约22nm，呈二十面体立体对称结构，无囊膜，壳粒32个。CPV能引起犬的急性、接触性、高度致死性传染病，临床以剧烈呕吐、出血性肠炎或非化脓性心肌炎和白细胞显著减少为主要特征，有两种临床表现型，出血性肠炎型和心肌炎型。以幼犬最易感，发病率为50～100％，病死率在10～50％，是危害宠物犬、警犬以及其他犬科动物最重要病原之一。1982年我国首次报道了该病，随后在东北、华北和西南等地区的警犬和良种犬中陆续发生和蔓延。2001年该病广泛流行，造成了极大的损失。我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将犬细小病毒病列为三类动物疫病。疫苗免疫是预防该病的重要措施，而血凝抑制(HI)效价是评价免疫效果的重要指标，HI效价达到1:80时可以耐受CPV的攻击。目前市场上已有的CPV抗体检测胶体金试纸条以及其他检测CPV抗体的方法如ELISA试剂盒仅能测血清抗体是否阳性，而无法检测其抗体HI效价，因此无法确切评价疫苗免疫效果。血凝抑制试验作为检测CPV抗体的一种经典实验室方法，亦是国家标准方法(GB/T14926.57-2008)，但该试验的准确性和稳定性与CPV的毒株、红细胞的来源、反应温度、缓冲体系及其pH值等多种因素密切相关，不易被操作者所掌握，加之试验所需材料——猪红细胞采集、处理、保存问题，试验步骤繁琐等因素严重影响了该试验方法的广泛应用。胶体金免疫层析法(Colloidalgoldimmunochromatographyassay，CGIA)是由固相酶免疫测定技术发展而来的固相标记免疫测定的新技术。该方法具有使用方便快速，便于基层使用和现场使用；成本低，不需要特殊的仪器设备；结果读取直观等优点，已成为当前动物疫病检测领域中广泛采用的免疫学检测方法之一。目前，尚未有简便、快速的胶体金试纸条可用于犬血清中CPV抗体HI效价的测定。
技术实现思路
根据上述领域的需求和不足，本专利技术提供一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。本专利技术的技术方案如下：一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条，其特征在于，在胶体金标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb；在检测线T线上同样包被有CPV治疗性单克隆抗体McAb；对照线C线上包被羊抗鼠IgG，所述CPV治疗性单克隆抗体为血凝相关单克隆抗体。在所述胶体金标记物垫上喷的胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为1-10μg/ml；在所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb的浓度为0.5-2mg/ml；所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度为0.5-2mg/ml。所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb与所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度比值为2:1。在所述胶体金标记物垫上喷的胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为3.72μg/ml；在所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb的浓度为1mg/ml；所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度为0.5mg/ml。检测时将犬血清从1:10开始倍比稀释，使用16抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以4即为犬血清中抗体HI效价；使用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以8即为HI效价；使用8抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以2即为HI效价；使用4抗原单位的标准抗原时，CGIA效价等于HI效价。检测时可使用32、16、8和4个抗原单位的标准抗原。上述的胶体金试纸条，其特征在于，反应时间为10-30min，反应温度为37±2℃，胶体金溶液的pH值为8.2。本专利技术还请求保护包括上述的胶体金试纸条的试剂盒。本专利技术还请求保护使用上述的胶体金试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法。本专利技术涉及的一种CPV治疗性单克隆抗体，由杂交瘤细胞(保藏号CGMCCNo.4304)分泌、制备腹水并纯化而得。上述单克隆抗体在CPV抗体HI效价检测中的应用。其特征在于，CPV的结构特点是立体对称的，因此存在多个相同的抗原表位，可同时结合两个以上相同的单抗；在胶体金标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb，反应膜检测线(T线)上同样包被CPV治疗性单克隆抗体McAb，而对照线(C线)上包被羊抗鼠IgG；检测时，先将样本倍比稀释后与CPV标准抗原等体积混合，稀释样本中抗体与CPV标准抗原上的血凝素结合，当CPV标准抗原未完全被中和时，则剩余CPV与Au-McAb结合形成复合物，进而与T线上的McAb结合显色；当样本中抗体完全中和了CPV标准抗原，则无剩余CPV可与Au-McAb形成复合物，T线不显色。一种利用胶体金免疫层析技术，建立的简便、快速测定CPV抗体HI效价的方法。其特征在于将犬血清倍比稀释后，分别与16个抗原单位的CPV标准抗原1:1等体积混合，在37±2℃反应一段时间后，滴入上述CPV治疗性单克隆抗体制备的胶体金试纸条，以T线消失的最大血清稀释度乘以4为犬血清CPV抗体HI效价。本专利技术中试纸条检测线(T线)消失时的血清最高稀释倍数为试纸条检测效价即CGIA效价。本专利技术中所用单抗为根据国标方法筛选的特异性针对血凝素的单抗，本专利技术专利技术人通过大量的实验验证以及深入的综合分析得出在本专利技术试纸条的各个相应的生物垫上包被特定的生物试剂可特异性结合标准抗原(CPV病毒)上的血凝素从而捕获抗原，犬血清与标准抗原反应后，本试纸条通过是否检测到游离血凝素从而间接反应出犬血清抗体的HI效价。并在本专利技术试纸条的各个相应的生物垫上包被特定比例范围的生物试剂可使相应的效果更加明显。本专利技术提供了运用试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法，可替代血凝血抑的方法，大大简便了实验操作并缩短了操作时间，降低了对操作者的要求，扩大了使用范围。本专利技术试纸条用于犬血清抗体HI效价的定性检测时，只需将犬血清直接稀释至1:20(使用16个抗原单位的标准抗原)检测即可，若试纸条检测血清CGIA效价≥1:20，即HI效价≥1:80，则说明免疫合格；若CGIA<1:20，即HI效价<1:80，则说明免疫不合格。同理，使用其他抗原单位的标准抗原检测时，只需将犬血清分别稀释至1:10(32个抗原单位检测)、1:40(8个抗原单位检测)1:80(4个抗原单位检测)。杂交瘤细胞保藏信息：杂交瘤细胞株名称：CPV1D3菌株分类：小鼠杂交瘤细胞系保藏编号为：CGMCCNo.4304保藏日期：2010年11月03日保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号附图说明图1为试纸条内部结构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条，其特征在于，在胶体金标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au‑McAb；在反应膜检测线T线上同样包被有CPV治疗性单克隆抗体McAb；对照线C线上包被羊抗鼠IgG，所述CPV治疗性单克隆抗体为血凝相关单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条，其特征在于，在胶体金
标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb；在反应膜检测线T线
上同样包被有CPV治疗性单克隆抗体McAb；对照线C线上包被羊抗鼠IgG，所述CPV治
疗性单克隆抗体为血凝相关单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，在所述胶体金标记物垫上喷的胶
体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为1-10μg/ml；在所述检测线T线上包被的CPV治
疗性单克隆抗体McAb的浓度为0.5-2mg/ml；所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度为
0.5-2mg/ml。
3.根据权利要求2所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线T线上包被的CPV
治疗性单克隆抗体McAb与所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度比值为2:1。
4.根据权利要求3所述的胶体金试纸条，其特征在于，在所述胶体金标记物垫上喷的胶
体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为3.72μg/ml；在所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，陈西钊，申屠芬琴，马永缨，杨欣艳，
申请(专利权)人：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11