一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用。该发明专利技术使用鹿茸多肽的氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM。浓度为0～1ug/ml的鹿茸多肽，为促进间充质干细胞的迁移；浓度为5～50ug/ml的鹿茸多肽，为抑制间充质干细胞的迁移；该应用对提高脂肪间充质干细胞向受损缺血心肌组织中的迁移能力，治疗心肌梗塞及对移植后心肌的修复至关重要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，涉及鹿茸多肽(VAPs)在影响间充质干细胞(ADSCs)迁移中的应用。
技术介绍
鹿茸——归肝、肾经，补肾阳、益精血、强筋骨。属于传统中药之一。中华人民共和国药典(2005年版一部)将鹿茸功能与主治叙述为：壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。用于阳痿滑精，冷宫不孕，赢瘦，神疲，畏寒，眩晕耳鸣耳聋，腰膝冷痛，筋骨冷软，崩漏带下，阴疽不敛。鹿茸是隶属于脊索动物门哺乳纲鹿科的动物，它是梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化并且密生绒毛的幼角。鹿茸史载于《神农本草经》，指出:“鹿茸专入命门、督，兼入肝。甘咸气温，禀纯阳之质，含发生之气”，属中品。李时珍曰:“龟、鹿皆灵而有寿。鹿鼻常反向尾，能通督脉，故取其角，以补命、补精、补气，皆以养阳也。乃物理之玄微，神工之能事”。而且，现代药理研究亦表明，鹿茸有抗炎作用，可抑制和清除自由基，延缓衰老，促进创伤愈合等作用，鹿茸中提取的鹿茸多肽能够促进体外软骨细胞、成骨细胞的增殖和分化，抑制软骨细胞调亡，同时，文献研究也提示，以鹿茸等为代表的归肝、肾经药物在治疗“痹症”的方剂中使用频率占到39.3％。鹿茸中含有比较复杂的化学成分，氨基酸的种类有19种以上，其中包括人体自身不能合成的必需氨基酸，10种磷脂成分，9种脂肪酸(生物活性最强的油酸、亚油酸、亚麻酸含量较高)、糖脂、糖，固醇类、激素样物质、前列腺素、脑素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸软骨素、多胺、肽类、脂蛋白、维生素、酶类及各种微量元素等。本专利技术所用鹿茸多肽为利用离子交换层析、凝胶过滤层析及反相高效液相色谱层析等生物化学技术，从梅花鹿茸中分离得到的1个新多肽，SDS-PAGE电泳显示为一条带，HPLC图谱为单一峰，MALDI-TOFMS给出该多肽的精确分子量为3263.4，其等电点pI＝8.15.一级结构研究表明，该多肽是由32个氨基酸残基组成的直链多肽，不含半胱氨酸，富含缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸。(张郑瑶等.\梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性.\高等学校化学学报33.9(2012):2000-2004.)脂肪间充质干细胞(ADSCs)是经过抽提脂肪组织并且经过分离培养所获得的一种纤维样细胞，是一种成体干细胞，与骨髓基质干细胞一样来自于中胚层，表面抗原与骨髓基质干细胞相似，且在在体外的培养条件、生长状态和表达标志物也与骨髓基质干细胞基本相同(ZukPA,ZhuM,AshjianP,etal.Humanadiposetissueisasourceofmultipotentstemcells[J].MolBiolCell,2002,13:4279一4295.)。具有来源广、丰富度高、损伤小、易于培养等优点。脂肪间充质干细胞具有多方面的作用，已经证明在治疗多种疾病方面具有巨大的潜力，可以诱导为神经元样细胞，治疗I型糖尿病、促进皮肤伤口愈合、减小急性及慢性肾损伤等。MarinaBurgos-Silva1等人的研究表明，脂肪间充质干细胞移植可以减少血清尿素，使肾衰竭小鼠的肾功能得到明显的改善(Burgos-SilvaM,Semedo-KurikiP,Donizetti-OliveiraC,CostaPB,CenedezeMA,HiyaneMI,etal.(2015)AdiposeTissue-DerivedStemCellsReduceAcuteandChronicKidneyDamageinMice.PLoSONE10(11):e0142183.doi:10.1371/journal.pone.0142183)。4周治疗后，可以减轻肾纤维化，减轻慢性炎症。脂肪间充质干细胞(ADSCs)在肾毒性损伤的治疗中起到积极的保护作用，可以通过调控细胞周期来抑制炎症，减轻肾脏损害，改进肾功能，抑制器官纤维化并长期提高免疫调节作用。通过在肾损伤的啮齿类动物中进行脂肪间充质干细胞治疗，证明可以用来减少组织炎症及肾损(MorigiM,IntronaM,ImbertiB,CornaD,AbbateM,RotaC,etal.(2008)Humanbonemarrowmesenchymalstemcellsacceleraterecoveryofacuterenalinjuryandprolongsurvivalinmice.StemCells26:2075–2082.doi:10.1634/stemcells.2007-0795PMID:18499895；FuruichiK,ShintaniH,SakaiY,OchiyaT,MatsushimaK,KanekoS,etal.(2012)Effectsofadiposederivedmesenchymalcellsonischemia-reperfusioninjuryinkidney.ClinExpNephrol16:679–689.doi:10.1007/s10157-012-0614-6PMID:22398959)。大量的实验已经证明，不同类型的干细胞在治疗肾损伤方面都具有明显的作用(FangTC,PangCY,ChiuSC,DingDC,TsaiRK(2012)Renoprotectiveeffectofhumanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcellsinimmunodeficientmicesufferingfromacutekidneyinjury.PLoSOne7：e46504.doi：10.1371/journal.pone.0046504PMID:23029541；FangTC,AlisonMR,CookHT,JefferyR,WrightNA,PoulsomR.(2005)Proliferationofbonemarrowderivedcellscontributestoregenerationafterfolicacid-inducedacutetubularinjury.JAmSocNephrol16:1723–1732.PMID:15814835)。而且，大多数的实验数据表明，干细胞治疗的主要机制是控制损伤发生过程中的炎症进程(StaggJ(2007)Immuneregulationbymesenchymalstemcells:twosidestothecoin.TissueAntigens69:1–9.PMID:17212702)。迄今为止，冠状动脉疾病的相关治疗手段已经取得了长足的进展，但是，急性心肌梗塞导致的死亡在世界范围内仍广泛存在(WallentinL,KristensenSD,AndersonJL,etal:Howcanweoptimizetheprocessesofcareforacutecoronarysyndromestoimproveoutcomes？AmHeartJ168:622-631,2014.)。急性心肌梗塞发生时的特点为，心脏内的血液和氧气供应量会急剧减少，产生不可逆的肌肉损伤及心肌细胞死亡。在梗塞区域包含大量无功能的心肌细胞，形成疤痕组织(SegersVFandLeeRT:Stem-celltherapyforcardiacdisease.N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用，其特征在于，包括如下步骤：第一步，细胞培养；培养细胞为间充质干细胞，使用低糖型培养基，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养；第二步，细胞消化；取处于对数生长期的间充质干细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液；第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀；第四步，细胞计数；调节细胞个数为3.3×105个/ml；第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板，在37℃，5％CO2培养箱中培养；第六步，划痕并加入鹿茸多肽；所述鹿茸多肽的氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM；当间充质干细胞处于对数生长期时，吸出培养基，进行细胞划痕，加入浓度为0～50ug/ml的鹿茸多肽，在37℃，5％CO2培养箱中培养12h；第七步，观察细胞迁移情况。

【技术特征摘要】
1.一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用，其特征在于，包括如下步骤：第一步，细胞培养；培养细胞为间充质干细胞，使用低糖型培养基，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养；第二步，细胞消化；取处于对数生长期的间充质干细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液；第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀；第四步，细胞计数；调节细胞个数为3.3×105个/ml；第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板，在37℃，5％CO2培养箱中培养；第六步，划痕并加入鹿茸多肽；所述鹿茸多肽的氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM；当间充质干细胞处于对数生长期时，吸出培养基，进行细胞划痕，加入浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：张郑瑶，李鹏飞，王晓龙，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21