一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法技术

本发明专利技术提供了一种基于硫化铜纳米模拟酶的无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，通过丝网印技术在可抛式环氧硅烷化的载玻片表面制得4×12免疫传感阵列，并将分散于壳聚糖的硫化铜纳米粒子滴涂于阵列微孔中；继续滴涂链酶亲和素于阵列微孔中，再将生物素化的抗体修饰于链酶亲和素功能化的硫化铜纳米粒子表面，封闭后即制得该无标记化学发光免疫传感器。该无标记化学发光免疫传感器可以对48个样品同时检测，改善了单组分无标记化学发光免疫分析模式分析时间长，劳动量大，试剂消耗多等缺陷，实现了多种肿瘤标志物廉价、快速、高通量、高灵敏的联合检测，适用于肿瘤早期的大规模筛查，具有非常重要的应用价值和实际意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学领域和化学发光分析领域，具体涉及一种多肿瘤标志物的无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法。
技术介绍
肿瘤的早期诊断与治疗是提高肿瘤患者存活率的关键。人血清中肿瘤标志物的含量与肿瘤的发展阶段有着密切的联系，其对肿瘤的鉴别诊断、辅助诊断、观察疗效、监测复发和愈后评价都有非常高的应用价值。因此，对肿瘤标志物可靠灵敏的检测是肿瘤筛查和预估的关键。然而，许多资料证实，不同的肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型既可能有共同的肿瘤标志物，也可能有不同的肿瘤标志物，因此寻找仅针对某一种肿瘤，并具有100％特异性和敏感性的“理想”肿瘤标志物是十分困难的，临床上为了提高肿瘤检测的准确性和可靠性，往往都是将检测与目标肿瘤相关的一组标志物，仅能检测一种肿瘤标志物的单组分分析方法已经满足不了临床诊断的需求，因此亟待发展多组分免疫分析新技术。多组分分析技术可以在单个分析流程中实现多种组分的同时或近同时检测，具有分析通量高、样品消耗少、所需时间短、分析成本低等优点。目前多组分免疫分析方法主要有空间分辨和多标记物两种模式。多标记物模式中，需要将多种标记物标记在蛋白上，存在标记步骤的复杂、费力、耗时，标记后的抗体或抗原分子生物活性降低等缺陷。多种标记物经常需要不同的最优分析条件，如各种标记酶催化反应的最优pH值、温度等都不相同，因此只能妥协某些条件从而导致较差的分析性能。此外，由于化学发光的检测没有选择性，多种标记物之间相互干扰或化学发光信号的重叠也会使分析性能变差。空间分辨模式是当前多组分免疫分析模式中研究最多、应用最广的分析模式，其通过将各个组分按发光产生的位置不同来进行区分，然后以阵列检测器(如CID，CCD等)进行检测，从而得到相对应的组分含量。从理论上讲，只要基质足够大或者阵列足够小，集成化程度高，就可以在基质上构建大量阵列，以达到同时检测大量样品的目的。因此基于阵列法的空间分辨模式具有高分析通量和多检测对象，分析速度快，样品消耗少等优点，满足临床应用的实际需求，是多组分免疫分析的主流趋势。专利技术申请“一种基于纳米模拟酶的无标记化学发光免疫传感器及制备和分析方法”(专利申请号：201510919955.1)通过使用纳米模拟酶代替天然酶，改善了传统化学发光免疫分析中天然酶稳定性差，易受环境影响等缺点，使得构建的化学发光体系的稳定性和灵敏度得到显著的提高，但是这个基于纳米模拟酶的无标记化学发光免疫传感器一次只能进行单组份免疫分析，存在分析时间长，劳动量大，试剂消耗多等缺陷，这极大地限制了该传感器的临床应用。因此本专利技术基于纳米模拟酶的无标记化学发光策略，进一步构建了免疫阵列传感器，实现了多种肿瘤标志物的同时、高通量检测，适用于肿瘤早期的大规模筛查，具有非常重要的应用价值和实际意义。
技术实现思路
本专利技术提出了一种基于纳米模拟酶的无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，用于多种肿瘤标志物的同时检测。本专利技术通过丝网印刷技术在可抛式环氧硅烷化的载玻片表面制得4×12免疫传感阵列，其包含48个检测位点，即可以对48个样品同时检测，并将分散于壳聚糖的硫化铜纳米粒子滴涂于阵列微孔中；再将生物素化的抗体修饰于链酶亲和素功能化的硫化铜纳米粒子表面，封闭后即制得该无标记化学发光免疫传感器；与抗原发生特异性免疫反应后形成的免疫复合物能有效阻碍化学发光底物向硫化铜纳米粒子的扩散并抑制模拟酶催化化学发光，引起化学发光信号强度的减弱，化学发光信号由电荷耦合检测器CCD收集。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，包括以下步骤：(1)使用丝网印刷机在环氧硅烷化的载玻片表面制作4×12传感阵列，形成48个阵列微孔；(2)将硫化铜纳米粒子超声分散于蒸馏水中，取硫化铜悬浊液与壳聚糖溶液等体积混合，超声分散均匀；取上述混合溶液滴涂于阵列微孔中，在室温下反应直至晾干；(3)取链酶亲和素溶液均匀滴涂于阵列微孔中，室温下反应后，4℃下放置过夜直至晾干，随后用磷酸盐缓冲液冲洗，在氮气气氛中吹干；(4)取多种生物素化的抗体继续滴涂于传感阵列的阵列微孔中，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；(5)将封闭液，均匀滴涂与阵列微孔中封闭多余的活性位点，在4℃下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；(6)取带有多种分析抗原的样品溶液加入阵列微孔中，在线温育；(7)取含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)冲洗免疫阵列，除去未反应的免疫试剂，在氮气气氛中吹干；(8)取化学发光底物滴入阵列微孔中；(9)化学发光阵列检测器采集化学发光信号。进一步地，步骤(1)中，4×12免疫传感阵列如图1所示，白色部分为环氧硅烷化的阵列微孔，直径为2mm，边缘间距为4mm；黑色部分为阵列微孔周围的载玻片，并印刷有具有疏水作用的绝缘油漆。进一步地，步骤(2)中所述的硫化铜纳米粒子用量为1.0-3.0mg，壳聚糖溶液的浓度为1.0-2.0wt％。进一步地，步骤(3)中所述的链酶亲和素溶液的浓度为20-50μg/mL。进一步地，步骤(4)中所述的生物素化的抗体的浓度为2-10μg/mL。进一步地，步骤(5)中所述的封闭液为1.0-5.0％牛血清蛋白溶液。进一步地，步骤(6)所述温育的时间为20-40min。进一步地，步骤(9)所述的化学发光阵列检测器为电荷耦合检测器CCD，动态积分时间为5-10min。进一步地，步骤(2)(3)(4)(5)(6)(8)所述的滴入阵列微孔中的试剂量为4-8μL。本专利技术达到了如下的有益效果：本专利技术基于硫化铜纳米模拟酶的无标记化学发光分析策略，构建了一种多组分免疫分析的传感器，通过化学发光成像实现了同时检测多种检测肿瘤标志物。本专利技术通过丝网印刷技术在可抛式环氧硅烷化的载玻片表面制得4×12免疫传感阵列，即可以对48个样品同时检测，并将分散于壳聚糖的硫化铜纳米粒子滴涂于阵列微孔中；再将生物素化的抗体修饰于链酶亲和素功能化的硫化铜纳米粒子表面，封闭后即制得该无标记化学发光免疫传感阵列。此外，本专利技术还构建了一种多肿瘤标志物的无标记化学发光成像免疫传感阵列的分析方法。本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术成功构建了免疫传感阵列，实现了空间分辨多组分免疫分析，改善了单组分免疫分析每次只能检测一个样品，存在分析时间长、劳动量大、试剂消耗多等缺陷。本专利技术所构建的免疫传感阵列能同时检测48个分析试样，具有高分析通量和多检测对象、分析速度快、样品消耗少等优点，满足临床应用的实际需求，适用于肿瘤早期的大规模筛查。(2)本专利技术每个阵列微孔中只需加入4-8μL免疫试剂，极大地减小了试剂用量，节省了分析成本。此外，小体积的阵列微孔减小免疫试剂向界面的扩散时间，加速了免疫试剂向界面的传质过程，从而缩短了免疫分析的时间，提高了分析的速度。(3)本专利技术构建的传感器具有高的灵敏性、准确性和稳定性，这是因为硫化铜具有大的比表面积和较强的吸附性能，结合生物素-链酶亲和素系统的放大效应，使传感阵列界面上修饰了大量的抗体。具有良好生物相容性的传感界面，不仅保持了抗体的生物活性，而且均一稳定的抗体层覆盖在硫化铜纳米粒子信号层之上，能高效捕获目标抗原形成免疫复合物，从而阻碍化学发光底物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于包括以下步骤：(1)使用丝网印刷机在环氧硅烷化的载玻片表面制作4×12传感阵列，形成48个阵列微孔；(2)将硫化铜纳米粒子超声分散于蒸馏水中，取硫化铜悬浊液与壳聚糖溶液等体积混合，超声分散均匀；取上述混合溶液滴涂于阵列微孔中，在室温下反应直至晾干；(3)取链酶亲和素溶液均匀滴涂于阵列微孔中，室温下反应后，4℃下放置过夜直至晾干，随后用磷酸盐缓冲液冲洗，在氮气气氛中吹干；(4)取多种生物素化的抗体继续滴涂于传感器的阵列微孔中，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；(5)将封闭液均匀滴涂于阵列微孔中，封闭多余的活性位点，在4℃下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；(6)取带有多种分析抗原的样品溶液加入阵列微孔中，在线温育；(7)取含0.05％Tween‑20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)冲洗免疫阵列，除去未反应的免疫试剂，在氮气气氛中吹干；(8)取化学发光底物滴入阵列微孔中；(9)化学发光阵列检测器采集化学发光信号。

【技术特征摘要】
1.一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于包括以下步骤：(1)使用丝网印刷机在环氧硅烷化的载玻片表面制作4×12传感阵列，形成48个阵列微孔；(2)将硫化铜纳米粒子超声分散于蒸馏水中，取硫化铜悬浊液与壳聚糖溶液等体积混合，超声分散均匀；取上述混合溶液滴涂于阵列微孔中，在室温下反应直至晾干；(3)取链酶亲和素溶液均匀滴涂于阵列微孔中，室温下反应后，4℃下放置过夜直至晾干，随后用磷酸盐缓冲液冲洗，在氮气气氛中吹干；(4)取多种生物素化的抗体继续滴涂于传感器的阵列微孔中，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；(5)将封闭液均匀滴涂于阵列微孔中，封闭多余的活性位点，在4℃下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，在氮气气氛中吹干；(6)取带有多种分析抗原的样品溶液加入阵列微孔中，在线温育；(7)取含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)冲洗免疫阵列，除去未反应的免疫试剂，在氮气气氛中吹干；(8)取化学发光底物滴入阵列微孔中；(9)化学发光阵列检测器采集化学发光信号。2.如权利要求1所述的一种多肿瘤标志物无标记化学发光成像免疫传感器的制备及分析方法，其特征在于，步骤(1)中，4×12免疫传感阵列中，阵列微孔周围的载玻片印刷有具有疏水作用的绝缘油漆，环氧硅烷化的阵列微孔直径为2mm，边缘间距为4mm。3.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨占军，曹越，李娟，胥蕾，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32