简便的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法技术

本发明专利技术公开了一种简便的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，包括引物设计、PCR扩增Bm‑myosin基因、Bm‑myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化、阳性重组克隆的筛选和鉴定、Bm‑MYOSIN二级结构预测、Bm‑MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测、Bm‑MYOSIN T细胞表位预测、表位基因片段的选择、目的基因片段原核表达载体构建、rBmM29重组蛋白表达和纯化等步骤。本发明专利技术方法简便、效果好。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号：201410617874.1、申请日：2014‐11‐05、名称“周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法”的分案申请。
本专利技术涉及一种周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法。
技术介绍
丝虫病是全世界重点控制的一种严重危害人类健康的疾病。为全球致残的第二大病因。据WHO报告，全球有83个国家和地区共有淋巴丝虫感染者约1.2亿。这些感染者中约4400万有淋巴丝虫病的临床表现，约7600万为微丝蚴血症者。估计全球有受威胁人口超过11亿，约占世界总人口的20％。我国曾是全球淋巴丝虫病流行最严重的国家之一，受威胁人口达3.3亿。虽然丝虫病的防治在全球范围内取得了巨大的成绩，但由于气候变暖等自然、生物和社会以及淋巴丝虫的夜现周期性和微丝蚴血症者多无临床症状等诸多因素的广泛存在，近年来在一些国家和地区出现疫情复燃和蔓延的趋势，丝虫病的流行不仅给人民的健康带来严重危害，也成为因病致贫的重要原因之一。抗丝虫感染的研究一直被世界各国专家学者所关注，如何抵御丝虫感染和侵袭，除药物和防蚊外，免疫预防已被视为一种重要的具有持效性的措施。研制有效的抗丝虫疫苗是摆在我们面前的重大课题。丝虫为多细胞人体寄生虫，生活史及抗原分子复杂，肌球蛋白作为生物体的一种重要的收缩蛋白质和抗原分子，有可能成为寄生虫疫苗和药物研究的重要靶分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种方法简便、效果好的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法。本专利技术的技术解决方案是：一种周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：(一)引物设计根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因的高度保守序列区,应用PrimerPremier5.0软件设计引物,并分别引入XhoⅠ/BamHⅠ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；P1:上游5’‐CCGGATCCATGAAATGCAAAAAAT‐3’下划线序列为BamHⅠ酶切位点Tm＝56.84P2:下游5’‐CCCTCGAGATGGTGAACGGAGTACG‐3’下划线序列为XhoⅠ酶切位点Tm＝66.90；(二)PCR扩增Bm‐myosin基因P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA1.5ul,10×PCRBuffer2.5ul,2.5mMdNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ulTaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O15.4ul；1℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；同时设立阴性对照；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(三)Bm‐myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化(1)纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物；(2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜；挑取单菌落于3mlLB培养基中,37℃振荡过夜；取300ul菌液加入30mlLB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5mlEppendorf管4℃离,8000rpm5min；弃上清,加入冰浴0.1mol/LMgCl2100ul悬浮,4℃离心,8000rpm5min,弃上清,加入冰浴0.1mol/LCaCl2‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用；(3)Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul1ul,共10ul混匀,4℃连接20h；(4)转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ulLB培养基,37℃孵育45min；将培养物100ul涂在含有X‐gal,IPTG,Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养；(四)阳性重组克隆的筛选和鉴定(1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒；(2)PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCRBuffer2.5ul,2.5mMdNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ulTaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O15.4ul；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；(4)测序鉴定:将含有Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒的大肠杆菌穿刺斜面测序；(五)Bm‐MYOSIN二级结构预测分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构；(六)Bm‐MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测；(七)Bm‐MYOSINT细胞表位预测(1)人源HLAⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLAⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；(2)鼠源MHCⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d，包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHCⅠ类分子，预测MHCⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；(3)人源HLAⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301、HLA‐DRB1*1501，预测HLAⅡ类分子结合肽，保留输出的结果；(4)鼠源MHCⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHCⅡ类分子结合肽，保留输出的结果；(八)表位基因片段的选择根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp‐1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29；应用Primer5软件本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简便的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，其特征是：包括下列步骤：(一)引物设计根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入XhoⅠ/BamHⅠ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’GGA TCC序列为BamHⅠ酶切位点；Tm＝56.84P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’CTC GAG序列为XhoⅠ酶切位点；Tm＝66.90；(二)PCR扩增Bm‐myosin基因P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA 1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix 4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；同时设立阴性对照；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(三)Bm‐myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化(1)纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物；(2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜；挑取单菌落于3ml LB培养基中,37℃振荡过夜；取300ul菌液加入30ml LB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5ml Eppendorf管4℃离心,8000rpm 5min；弃上清,加入冰浴的0.1mol/L MgCl2 100ul悬浮,4℃离心,8000rpm5min,弃上清,加入冰浴的0.1mol/L CaCl2‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用；(3)Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul 1ul,共10ul混匀,4℃连接20h；(4)转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ul LB培养基,37℃孵育45min；将培养物100ul涂在含有X‐gal、IPTG和Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养；(四)阳性重组克隆的筛选和鉴定(1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒；(2)PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamHⅠ与Xho Ⅰ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；(4)测序鉴定:将含有Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒的大肠杆菌穿刺斜面测序；(五)Bm‐MYOSIN二级结构预测分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构；(六)Bm‐MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测；(七)Bm‐MYOSIN T细胞表位预测(1)人源HLAⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLAⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；(2)鼠源MHCⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d，包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHCⅠ类分子，预测MHCⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；(3)人源HL...

【技术特征摘要】
1.一种简便的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，其特征是：包括下列步骤：(一)引物设计根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因的高度保守序列区,应用PrimerPremier5.0软件设计引物,并分别引入XhoⅠ/BamHⅠ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；P1:上游5’‐CCGGATCCATGAAATGCAAAAAAT‐3’GGATCC序列为BamHⅠ酶切位点；Tm＝56.84P2:下游5’‐CCCTCGAGATGGTGAACGGAGTACG‐3’CTCGAG序列为XhoⅠ酶切位点；Tm＝66.90；(二)PCR扩增Bm‐myosin基因P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA1.5ul,10×PCRBuffer2.5ul,2.5mMdNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul,ddH2O15.4ul；94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；同时设立阴性对照；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(三)Bm‐myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化(1)纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物；(2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜；挑取单菌落于3mlLB培养基中,37℃振荡过夜；取300ul菌液加入30mlLB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5mlEppendorf管4℃离心,8000rpm5min；弃上清,加入冰浴的0.1mol/LMgCl2100ul悬浮,4℃离心,8000rpm5min,弃上清,加入冰浴的0.1mol/LCaCl2‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用；(3)Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul1ul,共10ul混匀,4℃连接20h；(4)转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ulLB培养基,37℃孵育45min；将培养物100ul涂在含有X‐gal、IPTG和Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养；(四)阳性重组克隆的筛选和鉴定(1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒；(2)PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCRBuffer2.5ul,2.5mMdNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ulTaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O15.4ul；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；(4)测序鉴定:将含有Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒的大肠杆菌穿刺斜面测序；(五)Bm‐MYOSIN二级结构预测分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构；(六)Bm‐MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测；(七)Bm‐MYOSINT细胞表位预测(1)人源HLAⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLAⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；(2)鼠源MHCⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d，包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHCⅠ类分子，预测MHCⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；(3)人源HLAⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301和HLA‐DRB1*1501，预测HLAⅡ类分子结合肽，保留输出的结果；(4)鼠源MHCⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHCⅡ类分子结合肽，保留输出的结果；(八)表位基因片段的选择根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp‐1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29；应用Primer5软件设计引物；上游P1：5’‐GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC‐3’其中下划线序列为BamHⅠ酶切位点；下游P2：5’‐CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT其中下划线序列为EcoRⅠ酶切位点；引物使用前用ddH2O溶解，浓度为10μmol/L；(九)目的基因片段原核表达载体构建A、菌种活化和扩增(1)取保存于‐80℃的菌种，用接种环划菌于1.5％含Amp的琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现；(2)挑取单菌落，接种于4ml含Amp的LB液体培养基中，37℃恒温，220rpm振荡培养12‐14h；B、pET‐28a(+)质粒小量抽提(1)取3ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清；(2)加250μl悬浮液BufferS1充分悬浮细菌沉淀至无小菌块；(3)加250μl裂解液BufferS2，温和并充分地上下翻转4‐6次，使菌体充分裂解；(4)加350μl中和液BufferS3，温和并充分地上下翻转6‐8次，12000rpm离心10min；(5)吸取步骤4中的上清，转移到制备管，12000rpm离心1min，弃滤液；(6)向制备管中加500μl去盐液BufferW1，12000rpm离心1min，弃滤液；(7)向制备管中加700μl洗涤液BufferW2，12000rpm离心1min，弃滤液；重复该步骤一次；(8)将制备管置回离心管中...

【专利技术属性】
技术研发人员：方政，王颖颖，方浩，徐倩，吴佳倩，张波，王慧，陶然，谢东方，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32